异丙酚对家兔心肌钙稳态的影响

异丙酚对家兔心肌钙稳态的影响

在心脏疾病的保护下，心脏必须经历先锋剂的缺乏和其他损失。如果血液回流后心力衰竭，心肌细胞就无法立即恢复。该机制主要涉及氧自由基受损和心脏微细胞钙超载。越来越多的学者发现心肌细胞线粒体基质钙稳态能力恢复对再灌注后心功能的恢复起着重要的作用。有文献报道静脉麻醉药异丙酚可以影响心肌细胞的钙离子内流,也有文献报道异丙酚对心肌缺血/再灌注损伤具有一定的保护作用。机制可能是直接影响再灌注损伤时细胞钙超载的形成或通过其本身对抗氧自由基的功能起到对心肌的保护作用。本研究拟进一步观察异丙酚是否可以对心肌缺血/再灌注损伤时线粒体的钙稳态发生影响。材料和方法1.主动脉灌注rog健康成年新西兰大白兔24只(体重1.9~2.2kg)随机分为对照组(C组)、停跳缺血组(I组)、异丙酚停跳缺血组(P组)和高浓度异丙酚停跳缺血组(PH组),每组6只。腹腔注射25mg/kg的硫喷妥钠麻醉后肝素化,迅速剪开胸腔取下心脏用改良的Langendorff装置立即进行主动脉逆行灌注。其中P组和PH组的灌注液分别含有50μmol/L和200μmol/L的异丙酚(捷利康公司)待心率血压稳定后(约灌注开始后20min)C组心脏继续在恒温(37±0.2)℃和恒定的灌注压(7.84kPa)下持续灌注90min。I组、P组和PH组停止灌注并迅速经主动脉根部注入20ml的高钾停搏液(4℃)使心脏停止跳动,并将心脏浸于8℃~14℃的生理盐水中,每隔20min重复注射一次停搏液。心脏在停止灌注60min后,恢复停搏前的灌注(均能正常复跳)。再灌注30min。2.超微电镜sem和染色体分离灌注结束后,将心脏取下迅速浸入0℃的匀浆介质中(成分:225mmol/L的甘露醇,75mmol/L的蔗糖,1mmol/L的EDTA,0.25%的牛血清白蛋白,pH7.4),切取一小块心肌组织(心尖部)做超微电镜分析。其余部分心肌剪碎后进行匀浆并用差速分离的方法分离线粒体,分离过程中保证线粒体的温度不超过4℃。线粒体的洗涤液和终溶液均为0℃的180mmol/L的氯化钾溶液。最后线粒体沉淀制成2ml的悬液。3.色度、离心与悬液的制备用微量移液器抽取10μl的1mmol/LFura2-AM(sigma公司)加入线粒体悬液中,将线粒体悬液在37℃水浴中静置15min。15min后加入10倍体积的0℃180mmol/L的KCl在低温离心机内10000g离心3min后弃上清留沉淀。重复一次洗涤后将线粒体溶于2ml的冰KCl中制成悬液。并用Bradford的方法进行蛋白定量。4.实际荧光值测试分别取0.1ml的线粒体悬液加入5管测试介质液(测试介质液成分:120mmol/L的KCl,10mmol/L的MOPS,5mmol/L的glamate,5mmol/L的malate,pH7.0)中制成2ml的测试体系,在37℃水浴中温育5min。这5个测试管分别用于测量正常荧光值F,线粒体破膜(用0.1%TitonX-100)后的饱和钙(加入2.5mmol/L的CaCl2)及无钙(加入EGTA络合)的荧光值Fmax和Fmin,线粒体摄钙(加入0.5mmol/L的CaCl2)后荧光值Fu和释钙(加入10mmol/L的NaCl和1.0μmol/L的钌红)后的荧光值Fr。荧光测定在日立800型荧光分光光度计上完成,激发波长340nm和380nm,发射波长505nm,激发光栅5nm,发射光栅10nm。再根据文献的方法结合荧光值和蛋白浓度计算出线粒体基质的游离钙浓度(单位:nmol/mg蛋白)。以上步骤3和4均在避光的条件下完成。资料结果均用均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)的形式表示,在检验方差齐性的基础上采用方差分析进行数据处理(由SPSS软件完成),P<0.05认为有显著性差异。c组与c组的差异基因经历缺血/再灌注的I组、P组和PH组的线粒体基质游离钙浓度均显著高于C组。但I组、P组和PH组三组之间的基质游离钙浓度没有显著差别。当线粒体悬浮于远高于胞浆所能达到的高钙(0.5mmol/LCaCl2)测试介质液中时,四组线粒体游离钙浓度均开始升高,C组的基质游离钙浓度仍显著低于其它三组,但四组摄取钙的绝对值却没有显著差别。当四组线粒体悬浮于含钠离子(10mmol/L)和线粒体摄钙的抑制剂钌红的测试介质中时,四组线粒体基质游离钙浓度均明显下降,C组释放钙的量明显少于其它三组。I组、P组和PH组的超微电镜均显示线粒体水肿,I组的线粒体内有较多的黑色的高电子密度沉淀,而PH组则鲜见这种高电子密度沉淀(图1、2)。家兔土地内的钙离子含量和组成变化fura2-AM是一种荧光指示剂,可以以脂溶形式透过线粒体内膜并分解成游离酸形式与游离的钙离子结合使其激发波长由380nm移至340nm从而通过荧光变化测量游离钙离子的浓度。钙离子是目前所知唯一能够穿过线粒体内膜传达激素信号的胞内第二信使,在生理情况下,钙离子在0~4nmol/mg蛋白的浓度范围内。游离钙离子在线粒体内调控ATP的产生,因而其浓度对线粒体产能功能有着重要的调控作用。同时还对胞浆钙离子浓度起稳定作用。在心肌缺血阶段,线粒体的氧化磷酸化能力迅速下降,即使在心肌保护液的作用下,ATP的产量也下降。此时线粒体基质钙离子浓度已有升高,但此时钙离子进入线粒体的途径并不明确。当心肌恢复氧供(再灌注)时,细胞内产生大量的氧自由基和钙离子浓度升高出现钙超载。此时线粒体开始利用内膜两侧的电位差摄取钙离子和合成ATP,并且二者产生了竞争。线粒体优先利用氧化磷酸化建立的内膜两侧电位差摄取钙离子,而不能产生大量的ATP。由表中可以看出I组、P组和PH组的线粒体游离钙浓度明显高于C组。目前越来越多的实验研究证实是线粒体的钙超载而不是细胞浆的钙超载伴随着缺血再灌注损伤。线粒体钙超载产生再灌注损伤的重要机制之一就是线粒体基质钙浓度升高致使线粒体内膜开放一种渗透性转运孔道(mitochondrialpermeabilitytranstition,MPT)开放,从而可使达1500道尔顿的分子或离子可以通过线粒体内膜干扰线粒体的产能影响心功能。心肌线粒体这种非特异性孔道开放也被认为是心肌缺血/再灌注损伤的主要机制之一。线粒体基质钙超载是这种非特异性孔道开放的重要原因,尤其是伴有氧自由基的情况下。静脉麻醉药异丙酚具有抑制这种非特异性孔道开放的能力,但其机制至今尚未完全阐明。由于基质钙超载是线粒体非特异性孔道开放的重要原因,而异丙酚对细胞膜的钙内流有抑制作用,因而可能对线粒体内膜的钙转运也会有影响。已有研究证明异丙酚浓度在150μmol/L以上时可以影响肝线粒体对钙离子的摄取。但也有文献认为异丙酚主要是通过其氧自由基的清除作用来抑制非特异性孔道的开放。本研究采用荧光的方法直接测定缺血/再灌注后家兔心肌线粒体的基质钙浓度,摄取和释放钙离子的能力。发现在临床诱导峰浓度(50μmol/L,P组)和4倍的临床诱导峰浓度(200μmol/L,PH组)的异丙酚剂量作用下的心肌线粒体与未用异丙酚同样经历缺血再灌注的心肌线粒体(I组)相比,基质钙浓度并没有显著差别。当线粒体悬浮于高钙溶液时,三组的摄取值同样没有显著差别。同时与正常对照组相比也没有显著差别,可能在高钾停搏液的保护下,30min后线粒体已停止再灌注初期的病理性摄钙。当线粒体悬浮于含钠和特异性的钙离子摄取抑制剂钌红的测试介质液中时,可见三组线粒体表现出了明显的释钙能力,释钙量与C组相比有显著差别,并且可以将游离钙浓度降至正常的范围内。这说明在再灌注的恢复阶段,随着胞浆通过钙-钠交换降低胞浆钙离子浓度的同时,线粒体也可以通过与胞浆的钙-钠交换途径降低其游离钙浓度从而实现其功能的恢复。三组线粒体超微电镜可以观察到I组的线粒体内有以磷酸钙盐为主的二价阳离子致密黑色沉淀物。这主要是由于非特异性孔道开放使得大量无机磷等小分子可以透过内膜进入基质与高浓度的钙离子结合形成沉淀。而P组,尤其