运动对大鼠肾上腺一氧化氮合酶及细胞凋亡的影响

运动对大鼠肾上腺一氧化氮合酶及细胞凋亡的影响

肾上腺是人体的重要生理器，可以分泌各种肾上腺激素，这在人体的许多生理功能中起着重要作用。如果肾上腺皮肤和骨髓因增生和肿瘤而产生过多的激素，或者其他原因引起的肾上腺损伤，则会出现肾上腺功能障碍或萎缩等相关疾病。最近的研究表明，一些肾上腺疾病与晚发高血压密切相关。例如，嗜铬细胞瘤、谷合欢综合征和乙醛基丙烯酸酯增多也会导致晚发高血压。运动激励机几乎与所有器官和组织有关，肾脏也在其中。目前,多数研究是通过对肾上腺分泌激素水平来反映运动应激时肾上腺的功能状况,关于不同强度运动对大鼠肾上腺组织细胞凋亡与NOS表达的影响研究报道尚缺.本文旨在探讨不同强度运动对大鼠肾上腺产生的影响及其可能机制.1试验对象和方法1.1大鼠尾运动方案雄性SD大鼠24只(3月龄,由西安交通大学医学院动物管理中心提供),体重246.8±3.4g,国家标准啮类动物饲料喂养,自由饮食,室温17℃～23℃,湿度40%～60%.大鼠随机分为正常对照组、有氧运动组和大强度疲劳组.有氧运动组和大强度疲劳组采用递增强度方式进行跑台运动,运动负荷参照Bedford的研究进行.对照组正常笼内喂养,不运动.有氧运动组,共8周.起始速度为15m/min,时间为20min.递增速度为3m/min,时间为5min,运动至速度为20m/min后增加跑台坡度5%,时间为60min.疲劳运动组.递增速度3m/min,时间为5min,运动至速度为35m/min后增加跑台坡度10%,时间为60min.1.2样品的取样和准备20%乌拉坦腹腔麻醉,迅速开腹摘取肾上腺,10%中性甲醛固定,石蜡包埋、切片(厚5μm),常规脱蜡至水.1.3免疫总免疫组化采用SABC法,按试剂盒(博士德)说明书操作步骤进行.切片用去离子水冲洗,3%H2O2封闭,经微波抗原修复15min,磷酸盐缓冲液(Phosphatebuffersolution,PBS)冲洗,加生物素封闭液10min,滴加正常非免疫血清,滴加一抗(nNOS、iNOS、eNOS、Bax、Bcl-2均为1∶100,兔抗小鼠、大鼠、人多克隆抗体,博士德)4℃过夜,复温,PBS冲洗,滴加二抗,PBS冲洗,滴加SABC,Tween、PBS液洗2h,DAB显色,脱水,透明,封片.每次染色设阴性对照,用PBS取代一抗.1.4统计学分析采用OLMPUS显微图像分析系统测定平均光密度值(Meanopticaldensity,MOD),结果以均数±标准差表示,所有数据采用SPSS软件分析,组间比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义.2结果2.1两组nas和inos的比较免疫组织化学染色显示,NOS以棕黄色或棕色颗粒广泛分布在肾上腺皮质球状带、束状带和网状带.与对照组比较,有氧训练组nNOS、eNOS的MOD值显著增加,而iNOS值无显著变化;疲劳训练组NOS三个亚型的MOD值均显著性增加.与有氧运动组比较,疲劳运动组NOS三个亚型的MOD值均显著性增加(表1).3.2既有训练组中bax的变化情况免疫组织化学染色显示,Bax和Bcl-2均以棕黄色或棕色颗粒主要分布在肾上腺皮质球状带、束状带和部分髓质细胞的胞浆中.与对照组比较,有氧训练组中Bax的MOD值显著性下降,Bcl-2值显著性上升,Bcl-2/Bax比值更接近于1;疲劳训练组中Bax值显著上升,Bcl-2值显著下降,Bcl-2/Bax的比值更小于1.与有氧训练组比较,疲劳训练组中Bax值显著上升,Bcl-2值显著下降.表明不同强度运动对大鼠肾上腺组织细胞凋亡蛋白Bax和Bcl-2表达的影响不同(表2).3分析与讨论3.1no影响肾理酶制度的调节作用体内一氧化氮(nitrieoxide,NO)是由NOS催化L-精氨酸(L-arg)而生成.NOS有3个亚型,分别为eNOS、nNOS和iNOS.NOS是NO合成的限速酶,二者存在必然的依存关系.还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黄递酶(NADPH-d)是NOS的辅酶,组织化学中常被用来显示NOS.实验证实,肾上腺皮质球状带、网状带、束状带细胞和髓质部分嗜铬细胞均呈NADPH-d阳性,表明肾上腺实质细胞可广泛产生NO.文献报道,正常大鼠肾上腺皮质束状带主要表达eNOS和nNOS,运用逆转录-聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)并没有显示出iNOS蛋白的表达,分析原因可能是iNOS表达需一定刺激因素使其诱导产生.Natarajan等用免疫组织化学方法显示,正常大鼠肾上腺皮质球状带也有eNOS的表达.Cymeryng等证实,NO的供体SNAP(S-nitroso-N-acetylpenicy-llamine)和SNP(sodiumnitroprusside)对猪血小板能量代谢能显著降低大鼠在基础状态和应激状态(刺激ACTH增加)下肾上腺皮质束状带中皮质酮的产生量,经注入NOS抑制剂N-硝基-L精氨酸甲酯(L-NAME)后其皮质酮的分泌量显著增加,从而证实NO在调节肾上腺内分泌功能方面起着重要作用.Cymeryng随后又证实,肾上腺皮质束状带细胞生成的类固醇亦可被L-arg所抑制,说明NO参与了肾上腺类固醇分泌的调节作用,其意义在于适量的NO产生,抑制了肾上腺皮质束状带类固醇的合成而有利于防止过度的应激反应.Hanke等研究表明,适量的eNOS抑制了培养的肾上腺球状带细胞醛固酮的合成,且这种作用与培养细胞的氧浓度关系密切.Husain等实验证实,大鼠肾上腺血管紧张素浓度是血浆浓度的100多倍,肾上腺皮质球状带细胞膜上分布有血管紧张素Ⅱ-1型受体(AT1),该受体激活导致醛固酮分泌,肾上腺髓质嗜铬细胞膜上分布有血管紧张素Ⅱ-2型受体(AT2),该受体激活导致肾上腺素和去甲肾上腺素等儿茶酚胺物质的分泌,一氧化氮能够下调肾上腺血管紧张素受体,抑制醛固酮和儿茶酚胺物质的过多分泌,若用NOS抑制剂L-NAME抑制了NO的生成,则血管紧张素受体表达增加.综合上述观点,表明NO不同程度地调节着肾上腺的内分泌功能.运动对肾上腺NOS的影响尚无文献报道,但关于运动对肾上腺分泌物的影响已有诸多报道.经典理论认为,应激反应主要是交感-肾上腺髓质和下丘脑-垂体-肾上腺皮质(hypothalamopituitaryadrenal,HPA)轴相继活化,其糖皮质激素(glucocorticoid,GC)水平升高而启动一系列神经内分泌反应.适量GC分泌有利于机体动员能量和保持内环境的稳定,但若机体长期处于应激状态,机体始终处于高浓度GC中,即使是生理性的应激反应,对机体也将十分不利.已有实验表明,长期中小强度运动会对GC和ACTH等指标产生良好的适应性变化,适度的运动可使GC的分泌减少,白细胞膜上GC受体数目减少,并可提高IL-1水平.本文实验显示,有氧运动大鼠肾上腺eNOS和nNOS的表达显著性升高,iNOS无显著性变化,提示,有氧训练使肾上腺NOS合成适度增加,即NO的适度升高可能抑制或降低了GC随运动强度的持续升高,防治运动性疲劳的过早出现;同时运动所介导的适量NO生成可能下调了肾上腺血管紧张素受体,其意义在于防止过强生理性应激反应时,血压的偏高和对身体各个靶器官造成的损害.因此认为,肾上腺组织NOS的适量增加可能是有氧运动防治高血压等心血管疾病的机制之一.NO适量合成会对机体产生有益的影响,但大量NO合成会产生细胞毒性作用而损伤机体组织.研究显示,在关木通引起的肾上腺皮质增生和肾损害过程中,肾上腺损害早于肾脏损害,其毒性效应机制可能与DNA氧化损伤和NO增多有关.本文研究显示,与对照组和有氧运动组比较,疲劳运动激活了大鼠肾上腺组织内NOS的三个亚型表达,NOS活性的升高与NO的生成量成正比,疲劳运动可使NOS的活性过度升高,导致肾上腺组织内NO过度增加.过量NO可产生过多的NO-,NO-作为一种自由基和气体信使分子,可以自由通过细胞膜,从而攻击细胞膜,参与肾上腺细胞的损伤.由此提示,过量的NOS在肾上腺组织内的表达也是导致运动性疲劳的重要原因之一.3.2amh对肝肾组织中bax、bak和bcl-2表达的影响正常成年大鼠肾上腺组织内侧的网状带存在一定数量的凋亡细胞,Bax和Bcl-2主要在肾上腺皮质区上的束状带和网状带表达.Fogt等证实,正常人肾上腺皮质球状带、网状带、束状带细胞和部分髓质嗜咯细胞均可见Bcl-2蛋白的表达;在皮质肿瘤细胞和嗜咯细胞瘤中Bcl-2的表达显著下调.因此认为,Bcl-2的水平可作为衡量肾上腺是否发生肿瘤的一个显著标志.众所周知,Bcl-2家族中除Bax和Bcl-2外,尚有其他许多凋亡的相关基因,如p53和c-myc等,它们之间相互作用,通过形成同源或异源二聚体,或直接调控细胞凋亡.Bak和Bax一样是促进细胞凋亡的基因之一,正常人肾上腺Bak在皮质中表达,而在髓质不表达.目前认为,在Bcl-2家族中,尤其是Bax、Bak和Bcl-2的异常表达与诸多疾病的发生关系密切.朱述琳等对肾上腺髓质增生(AMH)大鼠和正常对照组大鼠的肾上腺组织细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax表达进行了检测,结果发现,AMH组大鼠组织Bcl-2的表达较正常对照组明显增强(P<0.05);而Bax的表达较正常对照组明显降低(P<0.05),提示Bcl-2表达增强而导致细胞凋亡的减少在AMH的发生过程中起重要作用,Bax的表达明显降低,提示其促进细胞凋亡的功能也降低,导致细胞凋亡减少,引起肾上腺髓质嗜铬细胞增生.另有文献报道,大鼠皮质束状带和网状带均有Bax和Bcl-2的表达,网状带的染色较深,二者的表达高于皮质束状带;摘除大鼠卵巢后肾上腺皮质束状带和网状带Bcl-2和Bax表达都增加;球状带中Bax表达增加,而Bcl-2表达阴性,补充17β-雌二醇后,束状带和网状带中Bcl-2蛋白表达均显著降低,Bax在束状带中表达极显著降低,而在网状带中没有阳性产物;在球状带中Bcl-2表达上升,而Bax表达下降.表明雌激素在肾上腺皮质各层发挥着复杂的作用.本文实验发现,经8周有氧训练的大鼠肾上腺与对照组比较,Bax表达显著性下降,而Bcl-2表达显著性上升,Bcl-2/Bax的比值更接近于1.Bcl-2蛋白家族成员是在细胞凋亡过程中起重要作用的一类蛋白质,Bax和Bcl-2基因分别是Bcl-2蛋白家族成员中表达产生的促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白,Bcl-2与Bax两者表达的比率直接决定了细胞凋亡的易感性,肾上腺结构与功能正常情况下两者的表达是适中的.在适量运动的情况下,肾上腺组织细胞凋亡受到抑制,正常细胞的生存占优势地位;经过8周疲劳训练的大鼠肾上腺组织与对照组和有氧训练组比较,Bax的表达均显著性升高,而Bcl-2的表达均显著性下降,Bcl-2/Bax比值减小,提示机体在进行大强度疲劳性运动后,肾上腺组织可能出现运动疲劳性损伤,肾上腺皮质和髓质凋亡动态失衡.3.3对大鼠肝肾nos表达的影响NO在许多生理和病理过程中发挥着重要作用,这种泛肽信号分子调节多种细胞的凋亡,细胞是否进入凋亡取决于促凋亡因子和抗凋亡因子之间的平衡与否.大量研究显示,NO具有促进细胞凋亡和抗细胞凋亡的双重特性,其促进凋亡和抗凋亡的作用很大程度上依赖于量的多少和所作用的细胞类型.高浓度的NO会增强细胞凋亡,低浓度时则会延缓细胞凋亡.有学者提出,来源于具有组织活性的内皮型和神经型的NO,通常对组织细胞产生一种生理性保护作用,而来源于iNOS的高剂量NO,则促进细胞的死亡,参与机体的病理生理过程.本文结果表明,在长期适度有氧训练后大鼠肾上腺NOS适度表达的同时,细胞凋亡受到抑制,使正常细胞的生存占优势地位;长时间疲劳训练激活了大鼠肾上腺iNOS高表达的同时,使得其他二个亚型的NOS