家兔热原实验的几点思考

家兔热原实验的几点思考

家蚕热原实验是对产品中热原的经典有效实验。许多国家还认为，它是热原检测的“黄金参考”。由于该实验是一个整体的动物实验,动物自身的行为、生理、外部环境等许多因素都可直接影响实验结果的准确性。尽管随着我国实验动物的饲养管理的规范化和标准的不断提高,外部环境对实验结果的影响在逐步减小,然而要保证热原实验结果的准确性,仍有许多因素需要探索。本文就本实验室对影响家兔热原实验的部分因素进行了探讨。1实验样品和试剂热原检测仪(型号:SIBP-PC100,上海生研所生产);家兔为普通级(购自北京市科宇公司,动物合格证号:01-5021);环境设施和饲养条件:为清洁级饲养环境,设施合格证号:01-4072;实验样品:来自不同的厂家,在实验时随机进行安排;给药剂量按规定的标准执行;其它:如酒精棉球,无菌无热原注射器等。数据处理:本文中所有数据的统计分析均使用SAS程序进行。2试验方法和结果2.1标准和检验方法对家兔不合格原因的影响按生物制品规程(以下简称规程)和药典预检温要求,在2003年12月24日至2004年5月10日对726只家兔进行预检温试验。结果见表1、表2。从表1可见,726只用规程筛选合格的家兔,如果采用药典的预检温方法和判定标准,仅有472只(65%)合格;即使按照0.5℃的判定标准,采用药典的0.5h采点计算,也有近16.5%的家兔不合格。经Fisher精确概率法统计,采用两种不同的方法,相同标准(0.5℃)的合格率差异也有显著意义。值得注意的是,在这726只规程判定合格的家兔中,如果用药典方法判定,35只体温低于38℃;134只温差在0.4到0.5℃之间。2.2不同预检温前家兔的心理变化下列实验结果是2003年11月14日购进的一批家兔,在本实验室适应9天,于11月24日进行预检温情况。实验的具体时间如下:预检温当天,早晨8点开始固定家兔,8:30固定结束,并开始打印数据,一直到16点结束,总计56只家兔。每隔30min采集、打印一次温度,预留不定的稳定时间,计算4h内的8个温度点的温差,并按照不超过0.4℃判为合格家兔。结果见表3。从表3可见,家兔因捉拿、运输、固定等造成的应激,随着预检温前的稳定时间的延长大约在1~1.5h基本消逝。这时的筛选率能够基本显示家兔的正常状况。稳定时间越长,筛选率越高(经双向有序且属性不同的2×8表的等级相关分析,p=0.0136)。但由于在测定热原时还需要约4h的固定时间,稳定时间过长,会出现动物的觅食等条件反射的一些影响,所以实际意义不大。2.3不同体温下的动物数该组数据来源于2003年7月至11月的热原实验结果,总计740只家兔,均为第一次进行热原实验。预检温和热原实验采用规程的要求,将每只家兔实验前的平均体温汇总统计,按体温≤38.5℃,在38.5~39.0℃之间和≥39.0℃的家兔划分为3组,对给予样品后的升温超过0.6℃的家兔进行统计。由于样品是随机安排,所以将样品的影响归为系统误差。结果见表4。表4显示了按基础体温高低划分的3组中出现的升温≥0.6℃的动物数以及低于0.6℃的动物数。经双向有序且属性不同的3×2表资料的线性趋势检验可见,各组之间差异显著。升温≥0.6℃的家兔数随基础体温的升高而显著下降(F=21.66,p<0.001)。2.4从测定时间上看下列数据采自与试验2同一批家兔,计算家兔经稳定后的体温波动情况,判定标准按照药典预检温要求,即每0.5h记录温度一次,4h内共采集8次,温差波动不超过0.4℃为合格。见表5。从表5可见,随着测定时间的延长,家兔的温差波动逐渐增大,合格率逐步降低(经双向有序且属性不同的2×4表的等级相关分析,P=0.0003)。3.5h内的合格数与4.5h内的合格数有显著的差异(P<0.1)。该数据有力地证明,在热原实验时,应该尽量缩短注射时间,使整个测温过程不超过4h,以便减少因动物自身体温波动增大而产生的假阳性。3选的标准不同3.1预检温与热原实验时操作程序及标准的不同是造成生物制品重复率高的重要原因规程规定的筛选方式为1h采温度点一次,与热原检测实验的采温方式不同(0.5h测体温一次);并且将体温波动不超过0.5℃的家兔判定为合格。我们的统计结果显示,当预检温改为0.5h测体温一次时,仍有大约11.7%的家兔体温波动超过0.5℃,其中有3.7%的家兔出现0.6℃以上的波动。这部分家兔在实验时,也许即使无热原刺激,仅仅因实验时增加的注射等人为因素即可出现升温超过0.6℃的现象,从而造成假阳性的结果或复试率升高。药典规定体温波动不超过0.4℃为合格家兔,并且预检温方式与实验方法完全一致;这样有效地减少了假阳性的发生率,因为经本实验室观察认为熟练的操作所产生的干扰使体温波动不超过0.25℃。所以建议筛选方式至少应采用与实验完全一致的方式。随热原仪的普及和软件完善,建议使用体温变化曲线来筛选家兔。本文的数据显示,家兔的基础体温在38.0~39.8℃的范围内,对热原的敏感性随基础体温的高低而有明显的差异;家兔基础体温越低,出现升温超过0.6℃的概率越大,即敏感性增高的可能性越大。为保证实验结果的客观公正,应尽量使用基础体温较一致的家兔进行实验。有关家兔的筛选方式和筛选标准方面,美国药典,一直采用除不注射外,其程序完全与实验程序一致的要求。对基础体温的要求则经过了修订:55年版(XV版)以前要求使用基础体温在38.9~39.8℃范围的家兔;从55年版(XV版)开始改为不使用体温超过39.8℃以上的家兔,对下限没有提及。因为使用低体温的家兔,其灵敏度大的概率高;实验的标准更严格了,所以没有必要规定。同时,试验者有更大的灵活性。英国药典和欧洲药典对基础体温的下限进行了设定,强调必须使用38.0~39.8℃范围内的家兔。但是,英国药典和欧洲药典的筛选方式以及实验结果的判定标准是与美国药典及我国药典有很大差异的。在筛选方式上,程序完全与实验过程一致,需要注射10ml生理盐水,且注射后体温波动不能超过0.6℃,方可使用;还有一条规定是在热原实验时,注射前应至少记录90min家兔的体温(30min一次),任何两次的体温差超过0.2℃的动物均不使用;另外,它们对实验结果的判定标准是以3只家兔的温差和计算的,不考虑单只升温超标问题。我国药典在1985年版前均规定使用体温在38.5~39.6℃范围内的家兔进行实验,直到1985版才改用38.0~39.6度范围内的家兔,并指出预检温的4h内(每h测温一次)温差波动不超过0.4℃;之后一直沿用到2000版使用前。2000版才根据美国的药典规定,将检测时间由1h测温一次改为0.5h测温一次(预检温和实验均一致)。而规程在1977年版中对动物体温的规定是38.3~39.6℃,且4h内的4次温差波动不超过0.5℃。到1990年版改为38.0~39.8℃范围,仍然是4h内的4次温差波动不超过0.5℃。1995年版没有修改;到2000年版做了较大修改,其中要求实验时的温度测定时间由1h改为0.5h,但这次对预检温的程序却没有任何修改,仍然是每h测温1次,4次温度的温差波动不超过0.5℃为合格。从我们的结果分析可见,这可能是目前造成我国生物制品热原试验复试率高的一个重要原因。3.2温度记录开始前的稳定时间对预检温筛选率和实验时的热原结果有显著影响由于运输、固定、注射等的应激刺激,家兔在1h后体温才能恢复正常,从我们的预检温的筛选率结果可见,第一个采温点应在固定后的60~90min左右为好;这也与英国药典的要求正好吻合。为保证热原实验结果的可靠性,应适当延长检温开始前的稳定时间。在样品检测时,美国药典经1990年的联合评价后,在1995年版(XXIII)改为0.5h测温间隔后,仍不将注射后的0.5h的体温计算在内,而是以其后的5点(1~3h)的最大升温和基础体温比较计算其最大升温温差,就是考虑到注射对家兔造成的应激应予以剔除。我们的实验结果发现,确实有个别家兔在注射后的0.5h体温最高,由于热原的正常反应时间多在1h以后,所以认为不计算第一点是科学的。我国药典至今仍将第一点计算在内,还没有修改。3.3合理地缩短热原实验的测温时间可有效保证热原实验结果的准确性测温时间越长,家兔自身的体温波动越大;在热原测定期间,给药时间的长短和给药熟练程度可直接影响热原实验结果的准确性。有关注射时间问题,美国药典也经历了几次修订:1960年版(XVI)前没有注明,1965年版(XVII)注明每只注射时间不超过2min,1970年版(XVIII)改为含糊的“简短时间”(briefperiodoftime),到1980年版(XX)再次明确,每组的实验注射时间在基础体温测出后不超过10min完成;之后一直沿用至今,从这个历程也可见其注重尽量控制整个实验的时间。我国药典从1985版开始注明注射时间应在测定正常体温后的15min内完成,也是注意到注射时间过长会造成结果的不准确性。因此建议使用固定的、注