东方百合鳞片扦插诱导小鳞茎形成过程及其鳞片内部糖和蛋白质的分布

东方百合鳞片扦插诱导小鳞茎形成过程及其鳞片内部糖和蛋白质的分布

“东方百合”来自荷兰。这朵花是粉红色的，带有味道（蔡素军等，2005）。作为一种新鲜的花，它深受消费者的喜爱（刘亚丽等，2004；杨勋等，2007）。鳞片扦插是其主要的繁殖方式,扦插过程中小鳞茎诱导的数量与鳞片的部位密切相关(Joungetal.,2001;王爱勤等,2004)。组织发育过程中糖和蛋白质的分布变化仅在红掌中有研究(陈超等,2008),其它植物中则没有发现。本试验采用容易诱导小鳞茎的中层和外层鳞片为试材,探寻扦插过程中小鳞茎的形态发生过程,及在此过程中扦插鳞片内糖和蛋白质的分布特点,以期能够了解鳞片扦插诱导小鳞茎的形成机理,探究糖和蛋白质对小鳞茎发生发育的影响,为东方百合小鳞茎的形成机理奠定理论基础。1移植后的样品处理试验于2005年12月1日—2006年1月1日在唐山师范学院温室内进行。以从荷兰进口的东方百合品种‘索邦’的种球为材料。将经过低温处理的种球外层和中层鳞片扦插于草炭∶蛭石为1∶1的基质中,定期浇水保湿。从扦插4d开始取样,每隔2d(10—15日内每隔1d)取样1次,每次5片,一个月后停止取材。未经扦插处理种球的外层和中层鳞片作对照。将鳞片洗净,切取靠近基部1cm左右的部分立即置于卡诺固定液(无水乙醇∶冰乙醇=3∶1)中固定24h,然后转入70%酒精中保存。不同时期扦插鳞片的基部用爱氏苏木精整染,高碘酸席夫试剂(PAS法)和氯化汞—溴酚蓝法分染。常规石蜡切片法制片,用LeicaRM2015切片机切片,厚度为12μm,郝普特明胶粘片剂粘片,加拿大树胶封片。对所制整染和分染切片进行观察比较,并用DT2000图像分析软件照相分析。2结果与分析2.1财产发育时期的确立2.1.1小鳞茎的形成过程小鳞茎起源于近轴基部8~14层的薄壁细胞,为内起源(图版Ⅰ,1),靠近分生细胞团的表皮细胞有破损现象。小鳞茎的形态发生过程依次经过了启动时期(图版Ⅰ,2)、生长锥形成时期(图版Ⅰ,3)、叶原基形成时期(图版Ⅰ,4)和小鳞茎形成时期(图版Ⅰ,5)。扦插鳞片的内外侧细胞有明显区别:内侧为体积较大,排列疏松的薄壁细胞,外侧细胞体积较小,排列密集(图版Ⅰ,6)。鳞片扦插6d小鳞茎开始启动,出现分生细胞团,且分生细胞团数较多,面积较小,此时期为小鳞茎的启动时期。扦插10d左右小鳞茎形成的部位与方向已初步确定,鳞片中部分分生组织细胞分裂现象明显,分生细胞团的面积扩大,靠近分生细胞团的鳞片表层细胞开始分裂。鳞片扦插20d左右,出现生长锥典型的原体原套结构,为生长锥形成时期。扦插25d可观察到叶原基的形成。扦插一个月左右可观察到小鳞茎,为小鳞茎形成时期(图版Ⅰ,5、7)。扦插鳞片能诱导形成多个小鳞茎,两个小鳞茎之间存在缝隙(图版Ⅰ,7)。另外,在小鳞茎形成过程中,高级分生组织的周围常常伴有小的次级分生细胞团(图版Ⅰ,8),随着高级分生细胞团的分化,次级分生细胞团逐渐消失。2.1.2小鳞茎形成的部位和方向扦插取样时发现小鳞茎多向鳞片内侧生长,个别向外生长。石蜡切片观察发现,鳞片的内层细胞较外层细胞的体积大(图版Ⅰ,8),内层表皮细胞常有破损现象(图版Ⅰ,1)。小鳞茎的形成具有一定的方向性,鳞片基部存在较多分生细胞团(图版Ⅰ,9),分生细胞团的位置决定它能否形成小鳞茎。中间和靠近外表皮的分生细胞团发育成小鳞茎的几率较小,小鳞茎多在扦插鳞片内侧形成。在启动时期,分生细胞团向内表皮一侧生长,内侧表皮细胞被撑破,逐渐被分生细胞团所取代。能够继续分化发育形成小鳞茎的分生细胞团除了具有大量分生能力的细胞之外,一般都占据靠近近轴基部内表皮的有利位置。2.1.3小鳞茎形成过程中染色体的变化扦插10d,分生组织细胞核中染色体变化活跃,靠近内表皮的分生细胞分裂旺盛。分生细胞的体积较未分化细胞大,这些细胞的染色体数明显多于未分裂的细胞(图版Ⅰ,10)。不能分化形成小鳞茎的分生细胞团迅速衰退死亡,能够发育形成小鳞茎的分生细胞团迅速增殖,分生细胞团不断扩大。此外还可观察到各个时期的染色体的分裂相(图版Ⅰ,11~13),中期染色体清晰可见。叶原基形成时期顶端分生组织分裂旺盛,如图版Ⅰ,14所示生长锥的原体原套结构中顶端分生组织最外面一层进行垂周分裂,内部的细胞则进行各种方向的分裂。2.2分生组织发生情况2.2.1PAS和氯化汞—溴酚蓝分染的效果PAS和氯化汞—溴酚蓝分染观察,席夫试剂(PAS染色)使颗粒状糖物质和可溶性糖均着色,细胞内的颗粒状糖物质呈深红色,维管组织和细胞内的可溶性糖物质呈浅红色(图版Ⅱ,1、2)。氯化汞—溴酚蓝对蛋白质的染色效果不是很好,因为试验材料本身蛋白质含量较低,只有细胞核所在部位轻微着蓝色(图版Ⅱ,3)。2.2.2分生组织及其周围细胞的组织化学分析爱氏苏木精整染发现分生细胞团呈漩涡状,细胞壁薄,体积小,细胞核较大,染色较深。PAS和氯化汞—溴酚蓝分染发现分生细胞内糖颗粒含量低,但蛋白质的含量较高,主要集中于细胞核的部位。分生组织细胞间排列紧密,没有细胞间隙(图版Ⅱ,1~3)。其周围的细胞则体积较大,细胞质浓厚,细胞内糖颗粒含量丰富,而蛋白质含量少。蛋白质和糖颗粒物质在分生细胞及其周围细胞之间存在着浓度梯度。对照组中(非分生组织中)糖和蛋白质均匀分布。由于小鳞茎形成初期维管组织并未形成,分生细胞在分化时首先需要周围的细胞供给营养和能量,营养在细胞之间发生流动,形成浓度梯度。分生细胞团外一层较大的细胞几乎不含糖颗粒,多糖已经被分生细胞所利用(图版Ⅱ,2)。分生细胞不断产生新的细胞,周围细胞的营养不断消耗而逐渐解体,分生细胞团不断扩大,最终分化形成小鳞茎。2.2.3小鳞茎形成过程中维管组织的变化随着分生细胞团的不断扩大,在分生细胞团周围形成维管组织(图版Ⅰ,4、15;图版Ⅱ,4~6)。对照组未扦插鳞片细胞中糖和蛋白质均匀分布,虽然也有维管组织的雏形,但并未见成形的维管组织。维管组织中颗粒性糖物质(淀粉粒)和蛋白质积累较少,可溶性糖含量高。另外,维管组织的发育与淀粉粒的含量有一定的关系。PAS染色发现维管组织周围细胞中淀粉粒含量明显高于其他部位,(图版Ⅱ,1、4~6),可见淀粉粒含量高时有利于维管组织的形成,这些维管束组织主要为筛管(图版Ⅰ,15)。筛管分子周围细胞含较多的颗粒状糖物质,糖分容易通过筛管分子运输到分生组织,有利于分生细胞进一步分化发育形成小鳞茎。2.2.4小鳞茎形成时期细胞内糖和蛋白质分布变化小鳞茎形成时期鳞片各处糖和蛋白质分布不均匀,分染可观察到糖颗粒与蛋白质的分布情况(图版Ⅱ,7~9),顶端分生组织由内向外细胞中蛋白质含量降低,糖含量则升高。顶端分生组织在生长过程中吸收周围细胞的糖类作为能量来源。生长锥新生鳞片中可溶性糖含量较多,新生叶片中可观察到维管组织。顶端分生组织到周围的细胞中,多糖的含量由低到高(图版Ⅱ,8),这为分生组织吸收周围细胞的糖分奠定了浓度梯度。生长点顶端分生组织蛋白质含量较多,蛋白质主要集中于细胞核部位,此处细胞分裂非常旺盛(图版Ⅱ,9)。3小脏器的诱导发育细胞所处的位置决定其生理活性,在本试验中,近轴基部8~14层的薄壁细胞容易分化形成分生细胞团,进而形成小鳞茎,其它位置的细胞虽然能够形成分生细胞团,但不易形成小鳞茎。小鳞茎的形成除了受分生细胞团的位置影响外,还与分生细胞能否获得充分营养有关。本试验中分生细胞团本身含有大量的蛋白质,周围则富含多糖。丰富的蛋白质和多糖能够为小鳞茎的诱导形成提供结构物质和能量保障。王爱勤等(2004)在扦插过程中用冰冻切片观察发现小鳞茎发生的最早部位是正对鳞片主脉维管束的内表皮,其次是侧脉维管组织,可能与维管束是水和营养物质的运输系统有关,越靠近输导组织的部位越先获得充足的营养,分化形成小鳞茎的几率也越大,而营养不能供应的部位则退化,这与本试验所得结论一致。罗丽萍等(2001)在探究鳞片不同部位诱导小鳞茎的试验中得出,处于鳞片叶下部的细胞内源激素水平高、贮藏的营养物质丰富,在同样条件下,更易诱导出小鳞茎。分生细胞团块能否形成小鳞茎除了营养物质和内源激素含量及分布有关,还有没有其它原因促进了小鳞茎的形成,有待于进一步研究。小鳞茎形成过程中,宁云芬等(2003)认为分生组织不经愈伤组织阶段可以直接形成小鳞茎。乔永旭等(2007)通过组培试验证实小鳞茎的形成可以经过愈伤组织途径。本次试验采取鳞片扦插,几天后鳞片内分生细胞团的数量迅速增多,细胞团分化到一定程度后直接形成了小鳞茎,与宁云芬等(2003)的研究结果相一致。造成这种现象的原因可能由于鳞片所