超高效液相色谱-串联质谱法测定11种甾体激素残留

超高效液相色谱-串联质谱法测定11种甾体激素残留

蛋白质同化激素（aas）是一种具有环戊烷和多羟磷母核的激素药物，主要是具有蛋白质同化作用的雄性激素。它们能促进畜禽生长,提高饲料转化率,有利于蛋白质的沉积,在畜牧业养殖中经常使用。但蛋白同化激素在动物食品中的残留可能会危及消费者的健康,具有潜在的致癌性。欧盟从1998年就禁止生长激素用于食品动物的饲养,国际食品法典委员会(CAC)、美国、日本等组织和国家对动物食品中蛋白同化类激素的残留都有严格的要求。我国农业部于2002年发布的第235号文件中规定丙酸睾酮、苯丙酸诺龙、甲睾酮、群勃龙等在动物性食品中的最高残留限量为不得在动物性食品中检出。因此,检测可食性动物源食品中蛋白同化类激素及其代谢产物残留量是一项重要的指标。动物组织中蛋白同化激素类药物的分析方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)和液相色谱-质谱法(LC-MS)。其中GC-MS需要对蛋白同化激素进行衍生,操作复杂,重现性差。LC-MS具有高灵敏度、高选择性的特点,能够对复杂基质中的痕量组分进行定性和定量分析。随着各国对药物残留量要求的不断提高和残留检测技术的不断进步,采用液(气)相色谱和串联质谱联用检测方法已成为各国认可的主要方法。通过对动物源食品中AAS多残留的提取、净化及仪器分析方法的研究探讨,本实验建立了超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)同时检测猪、牛、羊及鸡的肌肉组织与鸡蛋中睾酮、甲基睾酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、司坦唑醇、丙酸诺龙、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙等10种蛋白同化激素类药物和孕激素黄体酮残留量的快速方法。1实验部分1.1药物、药物和试剂ACQUITYTM超高压液相色谱仪和Micromass-QuattroPremier质谱仪(美国Waters公司)。睾酮(testosterone)、甲基睾酮(methyltestosterone)、黄体酮(progesterone)、群勃龙(trenbolone)、勃地龙(boldenone)、诺龙(nandrolone)、美雄酮(大力补,methandienone)、司坦唑醇(康力龙,stanozolol)、丙酸诺龙(nandrolonepropionate)及丙酸睾酮(testosteronepropionate)对照品购自德国Dr.Ehrenstorfer公司;苯丙酸诺龙(nadrolonephenylpropionate)对照品购自中国兽药监察所。叔丁基甲醚、乙腈、甲醇均为色谱纯(德国Merck公司);甲酸和碳酸钠均为分析纯(广州化学试剂厂);水为超纯水。1.2标准溶液的配制准确称取适量的睾酮、甲基睾酮、黄体酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、司坦唑醇、丙酸诺龙、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙,用甲醇分别配制成1g/L的单标准溶液及10mg/L的混合标准溶液,冰箱中保存,备用。1.3-质量分析的质量分析条件1.3.1萃取条件及流速ACQUITYUPLCBEHC18色谱柱(100mm×2.1mm,1.7μm)。流动相:A相为0.1%甲酸水溶液,B相为0.1%甲酸乙腈溶液;梯度洗脱程序:0→5.0min,50%B→90%B;5.0→7.0min,90%B;7.0→7.5min,90%B→50%B;7.5→10.0min,50%B;流速:0.3mL/min。柱温:室温。进样体积:10μL。1.3.2方法2:正离子模式离子源:电喷雾离子源(ESI),电压3200V,温度300℃。扫描方式:正离子模式。检测方式:多反应监测(MRM)。脱溶剂气、锥孔气均为高纯氮气,流速分别为600,20L/h;碰撞气为高纯氩气,压力为0.36Pa(3.6×10-3mbar)。锥孔电压、碰撞能量及定性离子对、定量离子对等参数见表1。1.4样品制备称取约500g猪、牛、羊或鸡肌肉组织,切碎后匀浆备用;取10枚鲜鸡蛋,去壳,均质备用。1.5离心液提取法称取5g均质试样(精确至0.01g),置于50mL离心管中,加入叔丁基甲醚25mL,于10000r/min均质30s,振荡10min;于4℃、6000r/min条件下离心10min,上清液转移至100mL梨形瓶中,残渣中再加入20mL叔丁基甲醚振荡提取一次。合并离心后的上清液,并用旋转蒸发仪于45℃水浴中蒸发至干。加入流动相A与B(体积比为1∶1)混合溶液2.0mL,超声溶解残渣,于-20℃冰箱中放置30min,取适量溶液于16000r/min下离心5min,上清液过0.22μm针头滤膜,滤液供测定。1.6标准空白标准溶液配制空白试样按照“1.5”节方法处理,取适量空白上清液加入不同量的蛋白同化激素标准储备液,配制成1,2,4,10,20及100μg/L的基质空白标准溶液,混匀后进样。以待测物色谱图的峰面积为纵坐标,相应待测物质量浓度为横坐标,进行回归运算,求得直线回归方程。1.7加标回收率的测定添加质量浓度为50,100,500μg/L的混合标准工作液0.1mL,制得1,2,10μg/kg添加水平的样品,按上述方法处理,测定回收率。1.8检出限和定量限取适量混合标准工作液,制得0.2,0.3,0.4,0.5μg/kg添加水平的样品,按“1.5”节所述方法处理,以最低检出浓度计算,3倍信噪比为检出限,10倍信噪比为定量限。2结果与讨论2.1式采集信号对于动物肌肉组织和鲜鸡蛋中多种甾体激素的分析,采用串联质谱MRM模式采集信号。在ESI+电离方式下,11种甾体激素都可形成稳定的[M+H]+准分子离子峰,然后进行相应的子离子全扫描,以确定MRM特征诊断离子,11种甾体激素选择的特征离子见表1,每种药物选择两个离子对。2.2不同激素的混合标准溶液的色谱行为基于超高效液相色谱分离的特点和要求,在优化的流动相条件下,11种甾体激素药物在10min内实现良好的分离,峰形对称,不拖尾,图1为11种激素混合标准溶液的MRM离子流色谱图。比较了乙酸铵缓冲溶液或甲酸水溶液(A相)与甲醇或乙腈(B相)组成对分离的影响。在正离子模式下,乙酸铵缓冲液与甲醇或乙腈有机溶剂在UPLC分离系统中,11种药物的色谱行为不理想;而在甲酸水溶液-乙腈流动体系,采用梯度洗脱,可实现11种甾体激素药物的快速分离,且峰形良好。2.3快速前处理条件的确定比较了甲醇、乙腈、乙酸乙酯和叔丁基甲醚等溶剂或其混合物的提取效果,发现用叔丁基甲醚提取的回收率高而且易于浓缩,故以此为提取溶剂。在兽药残留分析中,SPE是目前最为快速、有效的净化手段之一。考虑甾体激素类药物主要为由碳、氢及氧组成的中性化合物,极性较小,故进行了正相的氧化铝柱、氨基柱及反相C18柱的净化试验,但都不能有效地去除干扰,且降低了回收率。由于LC-MS本身具有较强的抗干扰能力,故本方法采用低温脱脂净化的快速前处理方法,对猪、牛、羊和鸡肌肉组织及鲜鸡蛋等动物源基质进行了方法学研究。实验表明,就5种动物源食品基质而言,猪与牛的肌肉组织一般脂肪含量相对较少,空白试样的MRM离子流色谱图中背景信号强度相对较低;羊肌肉组织脂肪较多,采取低温凝固处理后再缓慢解冻,取上清液过膜测定,可显著减少背景信号的强度;鸡肌肉组织空白试样的MRM离子流色谱图与羊肉组织背景信号强度类似,但在睾酮处有明显的色谱峰,应该为内源性睾酮,含量低于1μg/kg;鲜鸡蛋通过在碱性条件下用叔丁基甲醚沉淀蛋白,效果理想,进一步低温脱脂净化后,可获得背景信号较低的MRM离子流色谱图,在满足检测要求的条件下,还可减少定容体积,达到更低的检出限。典型的MRM提取离子流色谱图如图2所示,各通道均为提取的相应药物的定量离子流色谱图。2.4哌体激素药物的线性在1至100μg/L的质量浓度范围内,睾酮、甲基睾酮、黄体酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、司坦唑醇、丙酸诺龙、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙等11种甾体激素药物的线性良好,相关系数r均大于0.99。采用空白样品添加低浓度的标准品,按方法规定进行前处理,然后上机测定,以3倍信噪比作为检出限,10倍信噪比作为定量限,猪、牛、羊及鸡肌肉组织和鲜鸡蛋中睾酮、甲基睾酮、勃地龙、美雄酮及司坦唑醇检出限为0.3μg/kg,群勃龙、诺龙、黄体酮、丙酸诺龙、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙检出限为0.4μg/kg,定量限均为1.0μg/kg(见表2)。2.5回收率及精密度为消除或减少基质效应的影响,采用相应基质标准溶液单点校正法计算回收率。11种甾体激素类药物在1,2及10μg/kg添加水平时,猪、牛、羊及鸡肌肉组织和鲜鸡蛋中睾酮、甲基睾酮、勃地龙、美雄酮及司坦唑醇的回收率为62.3%～105%,相对标准偏差为0.5%～15%。17位碳上的—OH被酯化后的诺龙丙酸酯和苯丙酸酯、睾酮丙酸酯及17位碳上无—OH(被乙酰基取代)的黄体酮,因脂溶性大大增加,在冷冻离心脱脂过程中损失较大,因而回收率整体偏低,但大于50%,相对标准偏差小于16%(见表3)。3