第十三章 表观遗传学

表观遗传学（Epigenetics）第一节概述Epigenetics

“表观遗传学”、“表现遗传学”、“后生遗传学”、“外因遗传学”、“表遗传学”、“外区遗传学”。1942年的时候，C.H.Waddington

首次提出了Epigenetics

一词，并指出表观遗传与遗传是相对的，主要研究基因型和表型的关系。

后来R.Holiday提出了系统性论断，即表观遗传学研究的是没有DNA

序列变化的、可遗传的基因表达改变”。概念表观遗传学（Epigenetics）研究不涉及DNA序列改变的基因表达调控的可遗传变化机制的一门新兴遗传学分支。基因的表达第一节概述相同的基因型不同的表型表观遗传学(epigenetic)：DNA的序列不发生变化、基因表达改变、并且这种改变可稳定遗传。表观遗传学研究的内容：

基因选择性转录、表达的调控。基因转录后调控。表观遗传修饰从多个水平上调控基因表达：

DNA水平：DNA甲基化蛋白质水平：组蛋白修饰染色质水平：染色质重塑RNA水平：miRNA、RNA干扰表观遗传学的研究意义：表观遗传学补充了“中心法则”所忽略的两个问题，即哪些因素决定了基因的正常转录和翻译以及核酸并不是存储遗传信息的唯一载体。表观遗传信息可以通过控制基因的表达时间、空间和方式来调控各种生理反应。所以许多用DNA序列不能解释的现象都能够找到答案。与DNA序列的改变不同，许多表观遗传的改变是可逆的，这使表观遗传疾病的治愈成为可能。

DNA甲基化是目前研究得最清楚、也是最重要的表观遗传修饰形式。通过甲基供体——S-腺苷甲硫氨酸，并在DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase，DNMT)的催化下，CpG二核苷酸中的胞嘧啶环上5’位置的氢被活性甲基所取代，从而转变成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。DNA甲基化(DNAmethylation)第二节表观遗传修饰胞嘧啶甲基化反应

DNA复制酶CH3CH3CH3CH3DNA甲基转移酶CH3CH3CH3CH3DNA复制后甲基化型的维持CpG岛（CpGisland）甲基化抑制基因的表达DNA甲基化→基因沉默(genesilence)非甲基化(non-methylation)→基因活化(geneactivation)去甲基化(demethylation)→沉默基因的重新激活（reactivation）DNA高甲基化：基因启动子区的CpG岛在正常状态下一般是非甲基化的，当发生甲基化时，基因转录沉寂，使一些重要基因如抑癌基因、DNA修复基因等丧失功能，从而导致正常细胞的生长分化调控失常以及DNA损伤不能被及时修复，这与多种肿瘤形成密切相关。DNA低甲基化：整个基因组普遍低甲基化，这种广泛的低甲基化会造成基因的不稳定，这与多种肿瘤的发生有关。DNA的低甲基化也可能在异常组蛋白修饰的协同下引起某些T细胞基因的异常活化、导致自身免疫性疾病的发生。组蛋白修饰

DNA以染色质的形式存在，染色质通常由DNA、组蛋白、非组蛋白以及少量RNA包装而成，其中组蛋白是染色质的基本结构蛋白。组蛋白的N-末端可通过共价作用从而发生乙酰化、甲基化、泛素化以及磷酸化等翻译后的修饰，这些修饰的信息构成了丰富的组蛋白密码，其中乙酰化和甲基化是最为重要的修饰方式。组蛋白的不同修饰组蛋白乙酰化：

组蛋白乙酰化是由组蛋白乙酰基转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰基酶(HDAC)协调催化完成，修饰的部位一般位于N-末端保守的赖氨酸残基上。组蛋白乙酰化是一个可逆的动力学过程，可以调节基因的转录。组蛋白甲基化：组蛋白甲基化多发生于组蛋白H3、H4的赖氨酸(3位点)和精氨酸(2位点)残基上，由特异的组蛋白赖氨酸甲基转移酶(HMT)催化完成，也是一个可调控的动态修饰过程。而组蛋白的去甲基化是由赖氨酸去甲基酶(LSD1)催化完成。组蛋白的其他修饰：

组蛋白泛素化由E1、E2、E3级联酶催化修饰，也是一个可逆的动力学过程。所有组蛋白的组分均能磷酸化。组蛋白的各种修饰不是相互独立的，而是互相联系的，例如H3-Serl0的磷酸化可以促进H3-K14乙酰化，而H3-K9的甲基化则会阻止H3-Serl0的磷酸化。

动态的染色质重塑过程是大多数以DNA为模板的生物学过程的基础，如基因的转录、DNA的复制与修复等等，而这些生物学过程的混乱都与疾病的发生、发展直接相关，因此染色质重塑不仅能够调节基因的转录，同时还参与了与疾病发生密切相关的那些基础细胞生理过程。染色质重塑(remodeling)染色质重塑(remodeling)染色质重塑是指染色质位置、结构的变化，主要包括紧缩的染色质在核小体连接处发生松动、滑动，造成染色质的解压缩，从而影响启动子区中的顺式作用元件，为反式作用因子的结合提供了可能。核小体是染色体的基本结构单位，由DNA和组蛋白构成，是染色质的基本结构单位。由几种组蛋白：H1（H5）、H2A、H2B、H3和H4组成，每一种组蛋白各二个分子，形成一个组蛋白八聚体，约200bp的DNA分子盘绕在组蛋白八聚体构成的核心结构外面，形成了一个核小体。核小体染色质重塑与基因转录在近几年的生命科学研究中，从06年诺奖的siRNA，到这几年异常火爆的microRNA，到即将登场并定能风靡的lncRNA，非编码调控RNA无疑是研究最火的领域之一。研究发现，RNA不仅仅只承担遗传信息中间载体的辅助性角色，而是更多地承担了各种调控功能。非编码RNA调控(ncRNA)非编码RNA调控(ncRNA)功能性非编码RNA在表观遗传修饰中发挥极其重要的作用。ncRNA按照大小可分为两类：长链非编码RNA和短链非编码RNA。长链非编码RNA在基因簇乃至于整个染色体水平上发挥顺式调节作用，短链RNA在基因组水平对基因的表达进行调控。定义长链非编码RNA(long

noncodingRNA,lncRNA)◆长度在200-100000nt之间的RNA分子◆不编码蛋白◆lncRNA参与细胞内多种过程调控◆种类、数量、功能都不明确1)长链非编码RNA

lncRNA起初被认为是基因组转录的“噪音”，是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能。近年来的研究表明，哺乳动物基因组中4~9%的序列转录本是lncRNA（蛋白编码RNA1%)。lncRNA参与X染色体沉默，基因组印记以及染色质修饰，转录激活，转录干扰，核内运输等多种重要调控过程，使人们逐渐认识到基因组存在人类知之甚少的“暗物质”。虽然近年研究进展迅猛，但绝大部分的lncRNA的功能目前仍然不清楚。1)长链非编码RNAlncRNAs特征◆lncRNAs通常较长，具有mRNA样结构，经过剪接，具有polyA尾巴与启动子结构，分化过程中有动态的表达与不同的剪接方式。◆lncRNAs启动子同样可以结合转录因子，如Oct3/4，Nanog,CREB,Sp1,c-myc,Sox2与p53，局部染色质组蛋白同样具有特征性的修饰方式与结构特征。◆大多数的lncRNAs在组织分化发育过程中，都具有明显的时空表达特异性，如针对小鼠的1300个lncRNAs进行研究，发现在脑组织中的不同部位，lncRNAs具有不同的表达模式。◆在肿瘤与其他疾病中有特征性的表达方式。◆序列上保守性较低，只有约12%的lncRNA可在人类之外的其它生物中找到lncRNAs特征lncRNAs作用机制1编码蛋白的基因上游启动子区转录，干扰下游

基因的表达；2抑制RNA聚合酶II或者介导染色质重构以及组

蛋白修饰，影响下游基因的表达；3与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，干扰

mRNA的剪切，形成不同的剪切形式；4与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，在

Dicer酶的作用下产生内源性siRNA；5与特定蛋白质结合，lncRNA转录本可调节相应

蛋白的活性；6作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；7结合到特定蛋白质上，改变该蛋白质的细胞定

位；8作为小分子RNA（如miRNA、piRNA）的前体分

子。lncRNAs作用机制

X染色体的失活就是长链ncRNA所介导的甲基化和组蛋白修饰共同参与的一个复杂的过程。x染色体上的失活基因编码出相应RNA，这些RNA包裹在x染色体上，达到某一水平后，在甲基化和组蛋白修饰的参与下共同导致并维持x染色体的失活。此外长链ncRNA常在基因组中建立单等位基因表达模式，在核糖核蛋白复合物中充当催化中心，对染色质结构的改变发挥着重要的作用。2)短链非编码RNA短链非编码RNA(又称小RNA)能够介导mRNA的降解，诱导染色质结构的改变，决定着细胞的分化命运，还对外源的核酸序列有降解作用以保护本身的基因组。microRNAMicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22

个核苷酸的非编码单链RNA

分子，参与转录后基因表达调控。miRNAs据推测大都是由具有发夹结构。由70个碱基大小具有发夹结构的单链RNA前体，经过Dicer酶加工，生成有5’端磷酸基和3’羟基，大小约21—25nt的小分子RNA片断，定位于RNA前体的3’端或者5’端。到目前为止，在动植物以及病毒中已经发现数千种miRNA

分子。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。大多数miRNA

基因以单拷贝、多拷贝或基因簇的形式存在于基因组中。第一个被确认的miRNA——在线虫中首次发现的lin-4和let-7，可以通过部分互补结合到目的mRNA靶的3’非编码区(3’UTRs)，以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制，进而抑制蛋白质合成，从而调控线虫发育进程。microRNARNA干扰(RNAInterference,RNAi)真核生物mRNA编码区同源的外源双链RNA(DoubleStrandRNA,dsRNA)能特异地诱导其同源mRNA的降解，导致相应基因的沉默，这一现象被称为RNA干扰。

RNAi依赖于小干扰RNA(SmallInterferenceRNA,siRNA)与靶序列之间严格的碱基配对，具有很强的特异性。不同表观遗传学修饰之间的相互调控表观遗传修饰从多个水平上调控基因表达，而不同水平的调控之间也是相互关联的，任何一方面的异常都可能影响到其他水平的表观遗传修饰。事实上不同水平的表观遗传修饰在真核细胞中构成了一个完整的表观遗传调控网络。最初认为不同肿瘤细胞中的miRNA的表达异常是缺失或者突变的结果，但是一些最新研究显示miRNA的表达也会受到甲基化和其他表观遗传机制的影响。miRNA的表达受甲基化和其他表观遗传机制的调控siRNA诱导DNA的甲基化

siRNA诱导的转录水平基因沉默是通过指导基因组表观修饰完成的，包括指导基因组DNA甲基化和指导组蛋白修饰，siRNA指导的DNA甲基化具有精确特定的靶向性，在某种程度上与肿瘤细胞中抑癌基因特定沉默过程有关。第三节表观遗传疾病DNA甲基化与疾病DNA甲基化与肿瘤肿瘤细胞中的DNA甲基化一般表现为总体的低甲基化水平和特定区域的高甲基化，这些变化可以同时发生在同一肿瘤组织内。基因总体甲基化水平降低导致染色体不稳定、DNA修复基因、细胞周期调控基因、细胞凋亡基因相应的CpG岛的甲基化沉默，进而促进了肿瘤细胞的形成。肿瘤类型表观遗传修饰改变肺癌基因组水平的低甲基化、CpG岛高甲基化（p16INK4a、DAPK1、RASSF1A）、CBP基因组及染色体重组因子BRG1的缺失乳腺癌基因组水平的低甲基化、CpG岛高甲基化（BRCA1、E-cadherin、TMS1、雌激素受体）食管癌组蛋白去甲基基因JMJD2C/GASC1扩增、CpG岛高甲基化（p16INK4a、p14ARF）胃癌CpG岛高甲基化（hMLH1、E-cadherin、p14ARF、p16INK4a）肝癌基因组水平的低甲基化、CpG岛高甲基化（SOCS1、GSTP1、）、癌基因的低甲基化（c-fos、c-jun、c-myc）结直肠癌基因组水平的低甲基化、CpG岛高甲基化（hMLH1、p16INK4a、RARB2、SFRP1、WRN）、miRNA高甲基化、IGF2印记作用丢失、组蛋白修饰突变（EP300和HDAC2）、单乙酰化和组蛋白H4环丙烷形式的降低肾癌基因组水平的低甲基化、CpG岛高甲基化（VHL）、IGF2印记作用丢失膀胱癌基因组水平的低甲基化、CpG岛高甲基化（p16INK4a、TPEF/HPP1）、miRNA高甲基化前列腺癌基因组水平的低甲基化、CpG岛高甲基化（GSTP1）、组蛋白甲基转移酶EZH2基因扩增；组蛋白H3和H4异常修饰、癌基因的低甲基化（k-ras）卵巢癌CpG岛高甲基化（BRCA1）、微卫星DNA低甲基化神经胶质瘤CpG岛高甲基化（MGMT、EMP3和THBS1）淋巴瘤CpG岛高甲基化（p16INK4a、p73和MGMT）、单乙酰化和组蛋白H4环丙烷形式的降低白血病CpG岛高甲基化（p16INK4a、p15INK4b、EXT1和ID4、E-eadherin）、组蛋白修饰易位（CBP、MOZ、MORF、MLL1、MLL3和

NSD1）不同肿瘤中表观遗传学修饰的异常变化原癌基因(oncogene)：较低水平的原癌基因对于细胞的生长、发育、分化和信号传导都是必需的，当发生突变或基因异常表达时癌症就产生了。研究发现原癌基因通常在肿瘤新生物中呈现低甲基化状态。肿瘤抑制基因(tumorsuppressiongene)：肿瘤抑制基因的产物能够抑制细胞的生长，失去其功能将促进细胞的转化；与原癌基因在激活方式上的不同在于肿瘤抑制基因的激活必须有等位基因的两次突变或缺失。药物：叶酸和维生素B12都是甲基的供体，能影响甲基化的状态，主要是对全基因组甲基化上调的影响。环境因素：环境因素亦可影响肿瘤中基因的甲基化，从而间接的促进或影响肿瘤的发生。DNA甲基化与自身免疫性疾病DNA甲基化的改变可以影响一些与黏附分子和细胞因子表达相关的基因，导致T细胞的自身反应性改变，因此对维持T细胞的功能至关重要。研究证实，没有维持DNA甲基化水平和模式的成熟T细胞，在体内、外均能发生自身反应性，因此表观遗传的失控可以引起自身免疫性疾病。DNA甲基化与衰老DNA甲基化作为哺乳动物细胞基因组修饰和表达调控的后遗传方式，在细胞的衰老过程中总体水平下降，同时又伴随着某些基因的高甲基化。永生化细胞基因组的甲基化水平较高，因此甲基化水平过高又是肿瘤细胞的表现。目前年龄相关的甲基化已作为细胞生命历史的标签。DNA甲基化与心血管疾病心血管疾病被认为是受甲基化控制的人类重要疾病，对心血管疾病的DNA甲基化调控机制深入研究，有利于制定心血管疾病的有效防御策略，同时DNA甲基化的可逆性，为采用控制饮食及其他环境手段干预心血管疾病的进程提供了新的方法。DNA甲基化与精神疾病1972年Gottesman就将外遗传这一概念引入精神病遗传学研究。近些年当传统遗传研究在精神疾病的研究中困难重重时，外遗传与精神疾病尤其是DNA甲基化与精神分裂症的关系，引起了研究者的重视。虽然目前还处于假说阶段，但不少研究已提示DNA甲基化参与了精神分裂症的发生。组蛋白修饰、染色质重塑与疾病染色质重塑复合物、组蛋白修饰酶的突变均与转录调控、DNA甲基化、DNA重组、细胞周期、DNA复制和修复的异常相关，这些异常可以引起生长发育畸形，智力发育迟缓，甚至导致癌症。染色质重塑异常引发的疾病是由于重塑复合物中的关键蛋白突变导致染色质重塑失败，即核小体不能正确定位，并使DNA损伤修复复合物，基础转录装置等不能接近DNA，影响基因的正常表达。如果突变导致抑癌基因或调节细胞周期的蛋白出现异常将导致癌症的发生。乙酰化酶的突变导致正常基因不能表达，去乙酰化酶或一些去乙酰化酶相关蛋白的突变使去乙酰化酶错误募集将引发肿瘤等疾病。基因组印记与疾病基因组印记是指来自父方和母方的等位基因在通过精子和卵子传递给子代时发生了修饰，使带有亲代印记的等位基因具有不同的表达特性，这种修饰常为DNA甲基化修饰，也包括组蛋白乙酰化、甲基化等修饰。目前发现的印记基因大约80%成簇，这些成簇的基因被位于同一条链上的顺式作用位点所调控，该位点被称做印记中心(imprintingcenter,IC)。印记基因异常表达引发伴有复杂突变和表型缺陷的多种疾病，许多印记基因对胚胎和胎儿出生后的生长发育调节非常重要，对行为和大脑功能也有很大影响，印记基因的异常同样可诱发癌症。X染色体失活与疾病女性有两条X染色体，男性只有一条X染色体，为保持平衡，女性一条X染色体被永久失活——“剂量补偿”效应。X染色体随机失活是X失活中心(Xinactivationcenter,Xic)调控的。X染色体失活相关疾病多是由X染色体不对称失活使携带有突变等位基因的X染色体在多数细胞中具有活性所致。非编码RNA与疾病

ncRNA对细胞自身稳定和发育起着重要作用，而它们在肿瘤发生过程中的作用机制正在逐渐被认识。其中miRNA能够调控那些与发育、增殖、凋亡及应激反应相关基因的表达，而且它们的表达异常是人类恶性肿瘤的一个共同特征。人们对于表观遗传过程的关注程度日益增强，以DNA甲基化和组蛋白修饰为靶向的治疗方法也初露端倪；在表观遗传修饰分析技术发展的基础之上，我们可以进一步了解表观遗传过程的机制并设计出针对这一过程的治疗性干预手段。第四节表观遗传学研究技术DNA甲基化的检测基因组整体水平的甲基化分析高效液相色谱柱相关方法高效液相色谱仪结构示意图最明显优点在于,可用于高通量混合样本的检测，能明确显示目的基因组整体甲基化的水平，缺点：不能定位具体的甲基化位点。SssI甲基转移酶法缺点：SssI甲基转移酶不稳定，结果不够精确。氯乙醛法该法可以直接测定基因组整体的5mC水平，优点：所使用的试剂价格低廉且稳定性好，可以避免放射性污染，缺点：费时费力，且氯乙醛为有毒物质。基因特异位点的甲基化分析甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法该方法是一种经典的甲基化研究方法，优点：可同时检测基因组内多个位点。易解释，成本低廉。缺点：由于CG不仅限于CCGG序列中，因此非该序列中的CG将被忽略；只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态时，该检测方法的结果才有意义；样本量大；存在酶消化不完全引起假阳性的问题；不适用于混合样本。直接测序法重亚硫酸盐处理示意图该方法可靠性和精确度均较高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但是需要大量的克隆测序，操作过程繁琐且费用昂贵。甲基化特异性的PCR法优点：避免了使用限制性内切酶及相关问题；敏感性高，可用于石蜡包埋样本。缺点：对引物设计的要求高，可靠的引物需设计包含两或多个完全甲基化或非甲基化位点，限制了该方法的应用；只能作定性研究，不能作定量检测；重亚硫酸盐处理不完全导致结果假阳性。甲基化特异性的PCR示意图甲基化敏感性单核苷酸引物延伸法优点：可以检测特异位点甲基化情况且不受内切酶限制；通过设计不同的引物可在同一延伸反应中得到不同位点甲基化的情况；可检测甲基化位点分布不均的样本；能够定量检测甲基化水平；仅需少量的DNA，且可用于石蜡包埋样本。缺点：实验步骤略复杂，检测多位点时需设计多个引物，不能对较长序列进行全面检测；存在放射性污染及重亚硫酸盐处理不完全的问题。结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法优点：相对简单，不需预先知道位点及样本序列；可进行定量研究；检测所需的样本量较少，可用于石蜡包埋样本。缺点：只能获得特殊酶切位点甲基化情况，因此阴性检测结果不能排除样品中甲基化存在的可能；由于限制性内切酶和PCR的使用，序列分析受到限制。甲基化敏感性单链构象分析优点：可用于等位基因甲基化分析；能提示甲基化状态分布的不均性。缺点：只有甲基化水平较高的单链才能明显的区分开，而水平较低的不易分开，有时会因为甲基化位点的随机和不均匀分布导致电泳条带出现拥挤、拖尾的现象，故敏感性及准确性略低；检测的片段不宜过长。甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳优点：可以用来检测出除最高温度解链区域以外的所有发生甲基化的DNA片段，所需的样品量少，能较直观的显示出甲基化情况。缺点：解链温度和DGGE的变性浓度梯度需要摸索。甲基化敏感性解链曲线分析最大的优点：能够对甲基化分布不均匀的DNA样本进行半定量分析。缺点：不能够精确检测出甲基化的具体位点；研究序列的长度不宜过长；对低水平的DNA甲基化敏感性低。Methylight优点：高敏感、快速，非甲基化等位基因比例很高也能精确地检测出甲基化的等位基因，可做多样本、多位点分析，具备可重复性，所需的样本量少，不需电泳分离，能够为临床样本的研究提供可靠的技术支持。缺点：测定每个位点都要用一对引物和探针，费用高且受较多因素的影响。DNA微阵列法优点：可用于多样本、多位点甲基化的检测，检测所需的样本量少，适于临床样本；缺点：不能得到每个位点的信息，探针可能存在交叉杂交致结果假阳性，因此该方法进行检测时一定要设立对照。甲基化敏感性斑点分析优点：快速、简便、易于掌握，能够一次检测多种样本，包括石蜡包埋样本。缺点：检测序列不能过长；若探针错误杂交或重亚硫酸盐处理不完全，则可能出现假阳性或假阴性结果。MS-MLPA优点：所需的样本量少，由于探针具有非常短的识别序列，因此可以用于局部降解的DNA，如石蜡包埋的样本；可用于分析大量的混合样本，可一次检测多个靶基因中位点的甲基化情况。缺点：探针连接位点受限制性内切酶位点识别的限制，且要考虑到所用酶的反应适宜温度。新甲基化位点的筛查限制性标记基因组扫描优点：可一次得到多个位点甲基化的情况，利于新甲基化位点的寻找。缺点：RLGS图谱不能完全确认缺失的片段是由于甲基化还是由于样本本身缺失所致；对DNA质量要求高；结果复杂，不易解释。MBD柱层法优点：高通量，可对未知片段进行初筛，选出含有甲基化的片段进一步检测，快速、简便。缺点：DNA片段的特殊构型也可与MBD柱相结合，造成非特异性捕获引起假阳性；是一种定性而非定量的方法；由于MBD柱中所含多肽的量不完全相同，因此不同的MBD柱或多次使用的MBD柱的结果可能存在差异。COMPARE-MS该方法联合运用了MBD柱层法及MS-RE法，避免了单用MBD时非特异性捕获及单用内切酶时不完全消化所致的假阳性。在快速、简便同时，保证了结果的特异性和敏感性。缺点：需要使用限制性内切酶，因此不同程度地受到内切酶识别位点的限制。组蛋白修饰和染色质重塑的检测染色质免疫沉淀技术染色质免疫沉淀技术(ChIP)是研究DNA与蛋白质相互作用的重要工具。它可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。根据“组蛋白密码”学说，组蛋白的各种共价修饰的组合会以协同或拮抗的方式诱导特异的下游功能，因此染色质免疫沉淀技术也为研究组蛋白修饰在基因表达中的作用，全面阐明真核基因表达调控机制提供了强有力的工具。基本原理：生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声破碎将染色质随机切断为一定长度范围内的染色质片段，用所要研究的目的蛋白的特异性抗体沉淀交联复合体，再经过蛋白质与DNA解除偶联，最后纯化目的片段并检测。主要步骤：A.细胞固定；B.超声破碎断裂染色质；C.染色质的免疫沉淀；D.解除交联和纯化DNA；E.DNA的检测。染色质免疫沉淀结合芯片分析技术染色质免疫沉淀与芯片相结合技术(ChIP-on-chip)，成为研究目的蛋白质与全基因组中DNA相互作用位点的一种全基因组定位分析方法基本原理：生理状态下把细胞内的蛋白质和DNA交联在一起，超声波将其打碎为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过所要研究的目的蛋白质特异性抗体沉淀该复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，解交联；用LM-PCR扩增富集的DNA片段并用荧光染料Cy5进行标记；未经免疫沉淀富集的DNA片段也用LM-PCR扩增，但用另一种染料Cy3标记扩增产物。然后，将两组标记DNA与一张含有全基因组序列的DNA芯片进行杂交，从而大规模挖掘相关顺式调控元件，高通量地筛选已知蛋白质的未知DNA靶点与反式作用因子在整个基因组上的分布情况。全基因组定位技术全基因组定位技术(GMAT)是一种将染色质免疫沉淀和基因表达系列分析相结合的方法。它通过快速、详细地分析成千上万个EST来寻找表达丰度不同的SAGE标签序列来获得全基因组水平上的表达信息。基本原理：首先用抗某种修饰组蛋白尾端的抗体进行ChIP，获得细胞中与这种修饰的组蛋白相结合的全部DNA片段；然后利用SAGE技术构建文库并进行测序和生物信息学分析，从而获得这种组蛋白在全基因组中分布状况的信息。非变性染色质免疫沉淀技术非变性染色质免疫沉淀技术(nChIP)利用微球菌核酸酶把染色质消化成碎片，使用相应的抗体将含有蛋白或者修饰后蛋白的染色质片断进行免疫选择。nChIP分为三个阶段：染色质制备；免疫沉淀；DNA和蛋白质的分析。nChIP主要具有三个方面的优点：可以通过蔗糖梯度纯化微球菌核酸酶处理所得到的单个核小体作为实验所需的染色质，从而做到单核小体水平上的高分辨率定位；免疫沉淀所得到的蛋白质复合物可以直接通过考马斯亮蓝染色的聚丙烯酰胺电泳检测免疫沉淀的效率，没有甲醛交联这一步，可以在不改变蛋白质电荷的情况下恢复其状态，因而适于用酸-尿素-Triton胶来检测多方面的数据；nChIP实验染色质准备阶段中所丢失的蛋白质可能有助于对附着有转录因子的修饰后核小体的研究。染色质的构型研究DNaseⅠ高敏感性分析局部能转录的DNA形成能够结合DNaseⅠ的构象的特性，是的DNaseⅠ高敏性实验的基础。染色质构象捕获(3C)交联DNA片段之间的连接条件要远远优于随机片段，故通过PCR可定量分析两特定限制片段的交联频率，或两个基因位点相互作用的频率。三维荧光原位杂交技术高分辨率的三维荧光原位杂交技术(3DFISH)实现了染色体组空间结构和核内不同染色质区的分析。miRNA的检测与功能分析miRNA基因鉴定miRNA具有独特的结构和生物特性：成熟miRNA长度为21~23nt左右，可以利用RNA杂交分析或其它的实验方法进行鉴定，比如从小RNA文库直接克隆得到；miRNA前体具有发夹或折叠的二级结构，不含大的内部环状结构和突起，且成熟的miRNA应位于发夹结构的颈部；成熟的miRNA由Dicer加工而成，伴随Dicer功能活性的减少，可以检测到生物体中前体的积聚；成熟miRNA的序列和预测的发夹结构在不同物种间是保守的。迄今为止，miRNA获取的方法主要包括两种：直接从总RNA中克隆出小RNA，再根据生物信息学方法排除不符合miRNA结构的小RNA；以结构特征为基准，利用计算机辅助筛选法选出miRNA候选基因，再通过实验加以验证。正向、反向遗传学分析方法正向遗传学分析方法的原理是：把突变的基因从产生非正常表型的生物体或者组织当中分离出来，进行研究鉴定。反向遗传学分析方法的原理是：在体外引入特定的突变，例如定位诱变法，然后把已突变的基因放回到原来的宿主当中，而且常常是通过同型基因化或换位放回到宿主中原来的位置上，从而观察表型的改变。基因组实验方法该方法鉴定miRNA基因需要制备小RNA的cDNA文库。计算机预测法主要依据：首先，发夹结构是miRNA二级结构的基本特性，所有的预测法都需要考虑这一原则；其次，是依据miRNA序列和结构的保守性，这是区分miRNA候选基因和其它不相关发夹结构序列关键因素；最后，根据发夹结构的动力学稳定性和序列、结构的相似性，或者利用相关已知miRNA的遗传座位进行预测新的miRNA。miRNA靶标的鉴定miRNA靶标鉴定高效性影响因素第一，在动物中miRNA与靶基因mRNA以不精确的碱基互补配对结合于3’UTR。第二，miRNA

是序列短小的小分子，与3’UTR结合的方式存在多样性。另外，结合位点除了配对区还存在突环和错配区，这也给分析软件准确性带来障碍。第三，理论上预测出的靶标假阳性现象比较严重。第四，在进化过程中物种间的3’UTR序列相当保守，在这种情况下利用保守序列进行靶标的预测也没有用。第五，我们对很多哺乳动物基因组中的3’UTR碱基序列、座位、剪接多态性都不了解，有些生物只有一部分靶标的3’UTR特征被人们认识。miRNA靶标的计算机预测迄今为止，根据不同标准已经建立了很多计算机程序筛选法，主要包括：Mfold、miRanda、

miRanda

miRBase、TargetScan、

TargetScanS(DIANA-microT、PicTar、RNAhybrid)miRNA的检测R