乙烯信号转导途径在褐飞虱为害水稻挥发物释放中的作用

乙烯信号转导途径在褐飞虱为害水稻挥发物释放中的作用

植物被植物昆虫的攻击时，可以释放发射物，从而吸引植物昆虫的天敌。到目前为止，已经在20多种植物中进行了研究[3.6]。根据一些实地试验，这些发射物可以在自然条件下改善寄生虫和捕食者对植物昆虫的寄生虫和捕食者的影响。例如，对植物天花板释放机制的研究揭示了植物体内信号转导的路径对植物生长发育的影响。关于mo竺葵酸的信号转导路径，这方面的研究最为多。有关化学、药理学和阐明昆虫诱导植物释放的重要作用的文章也有明确的解释[11]。乙烯作为一种重要的植物激素,在植物的直接防御反应中发挥着重要作用.例如,乙烯信号转导途径参与拟南芥Arabidopsisthaliana中病程相关蛋白(PR)基因的表达,并且与植物体内的茉莉酸信号转导途径在调控植物对病虫的防御反应中起协同[19～21]或拮抗作用.外用乙烯利处理可以降低拟南芥对埃及棉铃虫Spodopteralittoralis的抗性,但不降低对菱形蛾Plutellaxylostella的抗性.然而,对于乙烯信号转导途径在植物挥发物释放中的作用,则至今只有少数报道,并且结果也不相一致.例如,Horiuchi等人的研究结果表明,用茉莉酸和乙烯的合成前体1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)处理的利马豆离体叶片的挥发物释放量比茉莉酸单独处理的明显增加.在对玉米的研究中也发现了类似的结果,乙烯能够促进由挥发物诱导素(volicitin)、茉莉酸或(Z)-3-hexenol诱导的植物挥发物的释放,但对于机械损伤却没有增强作用,同时乙烯本身亦对挥发物没有诱导作用.然而,在对烟草Nicotianaattenuata的研究中却发现,乙烯处理既不增加未处理植物的挥发物释放量,也不改变茉莉酸甲酯处理的植物挥发物组成相.最近,Huang等人在对另一种烟草Nicotianatabacum进行研究时,却发现乙烯可以调节烟草在病原物感染后挥发物的释放.本研究的目的是为了阐明乙烯信号转导途径在水稻重要害虫褐飞虱Nilaparvatalugens(Stål)为害诱导的水稻挥发物释放中的作用.以前的研究结果表明,褐飞虱为害可以系统性地诱导水稻挥发物的释放,并且这些挥发物对褐飞虱卵期的重要寄生蜂稻虱缨小蜂A.nilaparvataePangetWang具明显的引诱作用.褐飞虱唾液中的蛋白质类在褐飞虱为害诱导的水稻挥发物释放中起着重要作用,并且水稻体内的水杨酸信号转导途径参与了水稻挥发物的释放.为了阐明乙烯信号转导途径在褐飞虱为害诱导的水稻挥发物释放中的作用,我们首先测定了褐飞虱取食后水稻乙烯释放量的变化,以明确褐飞虱为害是否能激活水稻体内的乙烯信号转导途径然后,分析了外用乙烯(用乙烯利水溶液释放的乙烯)处理后水稻挥发物的变化及其对褐飞虱天敌稻虱缨小蜂的引诱作用.最后,测定了当水稻在乙烯受体抑制剂1-甲基环丙稀预先处理后,褐飞虱为害诱导的水稻挥发物的变化及其对寄生蜂的引诱作用.1稻绩效y型觉悟测定(ⅰ)水稻品种.供试的品种为秀水11和汕优63,对褐飞虱分别表现为中抗和敏感.在温室培养箱催芽后,分期播种于室外网室内,到秧龄20～25d时,把水稻移栽到塑料盆钵(直径16cm,高14cm)中(10或15根/盆),每天浇水,并分别在移栽后的15和25d各施一次尿素,每盆每次施尿素0.125g.移栽后30～40d的水稻供实验用.(ⅱ)虫源.褐飞虱Nilaparvatalugens虫源由中国水稻研究所提供,并按照Lou等人的方法在汕优63水稻上进行饲养.稻虱缨小蜂(AnagrusnilapartvataePangetWang)首先由带有褐飞虱卵的汕优63水稻苗从浙江大学华家池校区的实验农场中诱得,然后用带有褐飞虱卵的稻苗在玻璃试管(直径2.5cm,高20cm)中繁殖.饲养方法和条件同Lou等人的报道.(ⅲ)水稻的处理.(1)乙烯利处理.取盆栽水稻苗(每盆10根),用自来水小心冲洗干净.在50mL的烧杯中倒入20mL某一浓度(0.1,0.25,0.5,1或2mmol/L)的乙烯利(100%乙烯利,Sigma-Aldrich公司,美国)水溶液(pH7.2),烧杯置于每盆水稻苗的基部,各盆水稻用一个透光的密闭的聚氯乙稀塑料罩(直径12cm×高36cm)罩住.以相应的20mL的蒸馏水处理作为对照.所有水稻置于(28±2)℃,光照12h,相对湿度为70%～80%的人工气候室内,分别在处理后6,12或24h后用于生物测定和挥发物测定.(2)1-MCP处理.取一盆干净的水稻(10根)放在一个密闭的不锈钢边的透明的玻璃罩((55cm×60cm×58cm)内,将6mL某一浓度的安喜培™(0.07%1-MCP,台湾利统公司)水溶液(含安喜培™492,246或123mg,相当于含1-MCP0.344,0.172或0.086mg)倒入20mL的烧杯中,然后将烧杯放入玻璃罩内.以相应的6mL的蒸馏水处理作为对照.所有水稻置于(28±2)℃,光照12h,相对湿度为70%～80%的人工气候室内.待1-MCP熏蒸4h后,取出水稻苗,用于褐飞虱为害处理或其他实验.(3)褐飞虱为害.同前(1)处理,然后在每根稻苗茎秆上、下两个部位固定两个Parafilm膜做成的小袋(长6cm×宽5cm,每个小袋上用解剖针刺60个小孔),并内接怀卵褐飞虱雌成虫5头,使每根苗的接虫量达10头.以在相同部位固定两个空的Parafilm小袋作为对照处理的稻苗.水稻置于(28±2)℃,光照12h,湿度为75%的人工气候室内.稻株在处理后12h用于生物测定.(ⅳ)生物测定.稻虱缨小蜂对水稻挥发物的行为反应用“Y”形嗅觉仪测定.有关“Y”形嗅觉仪的详细描述及生物测定方法同Lou等人的研究.简而言之,“Y”型嗅觉仪的两臂及直管长度均为10.0cm内径1.0cm.“Y”型管两臂分别通过Teflon管与两个气味源瓶(φ6cm×46cm玻璃管)相连.气味源瓶内放置不同气味源.通常一个瓶内放处理植株,另一个瓶内放对照植株.在气流进入气味源瓶之前,先经过一个活性炭过滤器(φ1.8cm×10cm)和一个蒸馏水瓶,以净化空气和增加空气湿度.每臂的气流流量通过气体流量计控制在150mL/min.“Y”型嗅觉仪置于一敞开式的半透明长方形盒子(45cm×50cm×30cm)内,并在盒子的前方约25cm处水平安置2只20W的日光灯,以控制光照,平衡照明.所有的生物测定实验在09:00～17:00,25～28℃的生物测定实验室内进行.分别测定寄生蜂对不同成对气味源的选择行为反应:0.1(12h),0.25(12或24h),0.5(12或24h),1(6或12h)或2mmol/L(6或12h)乙烯利处理的水稻分别与相应的蒸馏水处理的水稻相比较;0.5(24h),1(12h)或2mmol/L(6或12h)乙烯利处理的水稻分别与褐飞虱为害水稻(12h)相比较;0.344,0.172或0.086mg1-MCP预处理(4h)后褐飞虱为害的水稻(12h)与蒸馏水预处理(4h)后褐飞虱为害的水稻(12h)相比较.为了测定处理溶液本身可能对寄生蜂行为的影响,我们分别测定了寄生蜂对500µL1mmol/L乙烯利和500µL0.172mg1-MCP水溶液的行为反应,均以500µL蒸馏水为对照.各处理以10根水稻苗作为气味源,每测定8头蜂则更换一批水稻苗.对于每组气味源至少测定32头雌蜂.(ⅴ)水稻挥发物的收集与鉴定.水稻挥发物的收集采用固相微萃取技术(SPME,美国Suplco公司)具体的提取方法同Lou等人的报道.分别对下列不同处理的水稻提取挥发物:0.5mmol/L乙烯利处理24h,2mmol/L乙烯利处理6或12h和蒸馏水处理的水稻;褐飞虱取食12h和作为对照的未处理的水稻;0.344,0.172或0.086mg1-MCP处理4h后褐飞虱取食12h和蒸馏水处理4h后褐飞虱取食12h的水稻;蒸馏水或0.172mg1-MCP处理4h的水稻.同时,对不加任何水稻的空玻璃筒也进行了捕集,以检验系统是否干净.每样品10根稻株,提取3h.各处理重复4次.实验在26～28℃的空调室内进行.利用气谱(Agilent-6890)-质谱(Agilent-5973)联用仪对挥发物进行分离与鉴定.对固相微萃取捕集的挥发物,直接在250℃的GC进样口内进行热解吸lmin,无分流进样.色谱柱为HP-5MS毛细管柱(30m×0.25mmID,膜厚0.25µm).柱温采用程序升温,40℃(2min)至250℃(2min),6℃/min.以99.999%高纯氦气作为载气,流量为1.0mL/min.气谱/质谱接口温度280℃;EI离子源,电离能70ev.通过核对谱库(NIST98)与标准化合物的质谱图,对挥发物的各组分进行定性分析,并利用外标法(200µL/L正八烷,进样量1µL)对各挥发物组分进行相对定量(相对于外标峰面积的百分比).(ⅵ)1-MCP对褐飞虱取食的影响.由于褐飞虱的不同为害程度会影响水稻挥发物的组成相及其对稻虱缨小蜂的引诱作用,因此我们测定了1-MCP对褐飞虱取食的影响,以明确1-MCP处理是否还会通过影响褐飞虱的取食而对水稻挥发物产生影响.1-MCP处理水稻的方法同上,用量为0.172mg;以相应的蒸馏水处理为对照.处理4h后,取出水稻,用Parafilm小袋将5头褐飞虱雌成虫固定在水稻的茎秆上.在(28±2)℃,12L:12D,湿度75%的人工气候室中取食24h后,分别测定取食不同处理水稻的褐飞虱的蜜露分泌量(mg/5头雌成虫).各处理重复6次.(ⅶ)乙烯含量的测定.取一盆稻苗(15株),在每根稻苗茎杆的上、中、下部各用Parafilm小袋接怀卵的褐飞虱雌成虫5头,每株稻苗上共接虫15头.以相同部位固定3个空的Parafilm小袋的稻苗作为对照.每盆稻苗均罩一密闭的塑料罩(40.5cm(高)×13cm(内径)).分别在褐飞虱开始取食后2,4,6,8,10,12,22和24h测定各塑料罩内的乙烯浓度.测定时,每次从密闭的罩子中取出5mL气体用气相色谱(HP6890)分析.每处理组的各时间点均重复3次.色谱柱为HayesepQ(80/100目,长1.8m,外径3.17mm,内径2.1mm,Supelco,美国),柱温70℃,进样口温度110℃,检测器温度为250℃.载气为N2,流速30mL/min.F1D检测器.以乙烯标准气体(浓度20.5µL/L,购自北京北分气体有限公司)(进样量5mL)对样品中的乙烯进行定性与外标法定量.(ⅷ)数据处理与分析.寄生蜂对不同气味源选择性的差异用χ2检验.挥发物数据利用方差分析(ANOVA)进行比较,如果方差分析差异显著(P<0.05),则进行Duncan’s新复极差法多重比较.乙烯含量的差异显著性采用t检验.数据用Statistica软件进行分析(Statistica,SAS,InstituteInc,Cary,NC,美国).2结果2.1乙烯释放量对褐飞保虾生态性的影响与未处理稻株相比,褐飞虱为害稻株的乙烯释放量在褐飞虱为害2h时就明显地增加,并且在整个测定的24h内乙烯浓度一直高于相应的对照稻株(图1).2.2分离和处理水稻挥发物与蒸馏水处理的水稻相比,用0.1mmol/L乙烯利处理12h,0.25mmol/L处理12h或24h以及0.5mmol/L处理12h或1mmol/L处理6h的水稻挥发物对寄生蜂没有显著的引诱作用;而用浓度为0.5mmol/L乙烯利处理24h及1mmol/L处理12h或2mmol/L处理6或12h的水稻挥发物对寄生蜂具有明显的引诱作用(图2),并且其引诱活性与褐飞虱为害稻株相当(图3)1mmol/L乙烯利处理的水稻释放出的乙烯本身对寄生蜂没有引诱作用,与对照蒸馏水各自引诱寄生蜂的数量均为16头(共测定32头).利用SPME共捕集到17种水稻挥发物组分,其中鉴定的有11种,包括7种烷烃类化合物、3种萜类化合物和1种醛类(表1和2).与未处理水稻相比,褐飞虱为害导致了水稻挥发物总量上升,并使化合物正十四烷、正十五烷、未知物3和4的含量增加,同时诱导了芳樟醇的释放(表1).与对照植物相比,外用乙烯利处理能引起与褐飞虱为害相类似的挥发物变化:挥发物总量和化合物正十四烷、正十五烷和未知物3的含量增加,并诱导芳樟醇释放.但在乙烯利处理的水稻和褐飞虱为害水稻之间挥发物组成相还存在一些差异:乙烯利处理没有增加未知物4的含量并且总的挥发物量和十二醛含量较后者低,而未知物5和正十八烷的含量较后者高(表1).2.31对褐飞病的处理对水稻挥发物释放的影响用1-MCP预处理水稻4h能降低褐飞虱为害水稻对稻虱缨小蜂的引诱作用,并且降低的程度与1-MCP的使用剂量成正相关(图4).而1-MCP本身对稻虱缨小蜂没有趋避作用(1-MCP水溶液引诱蜂数:蒸馏水诱蜂数=14:17,一头蜂没有作出选择反应)也不影响褐飞虱的取食(取食1-MCP处理水稻的5头褐飞虱雌成虫蜜露分泌量为30.45±4.80mg,取食蒸馏水处理水稻的为37.35±6.62mg).挥发物的分析结果表明,褐飞虱为害前用1-MCP处理会导致水稻挥发物总量和化合物正十四烷、1-十二醛、正十六烷、正二十烷、芳樟醇和未知物2～4释放量的降低(表2),在这些释放量减少的挥发物中包括了除正十五烷以外的所有褐飞虱为害时释放量增加的组分.此外,用高浓度的1-MCP预先处理,则会增加水稻的正十七烷释放量(表2)与对照相比,单独用1-MCP处理水稻只引起水稻挥发物轻微的变化:降低了β-环柠檬醛的释放量,而增加了正十六烷的释放量(图5).3植食性昆虫interpersonal导致的乙烯释放量的增加乙烯的测定结果表明,褐飞虱为害能在2h内导致水稻乙烯释放量的增加(图1),这一时间明显地短于褐飞虱(10头雌成虫/稻苗)诱导水稻挥发物生物合成和释放所需要的时间(6h),说明褐飞虱为害能激活水稻体内的乙烯信号转导途径,并且从乙烯与挥发物两者释放的时间次序来看,乙烯信号转导途径存在参与褐飞虱诱导的水稻挥发物的生物合成和释放的可能性.外用乙烯利处理的实验结果表明,当乙烯利达到一定浓度并经一定时间处理后,水稻能释放与褐飞虱为害稻株相类似的挥发物(表1),并且两者对寄生蜂的引诱活性相似(图2和3);如果外用乙烯处理的浓度足够高,如2mmol/L,则诱导水稻挥发物释放的时间短于6h(图2),与褐飞虱为害诱导水稻挥发物所需时间基本相当.此外,当水稻的乙烯受体被1-MCP所抑制,即当水稻不能识别乙烯时则由褐飞虱为害所导致的释放量增加的挥发物组分(除了正十五烷外)全部被抑制,并且对寄生蜂的引诱活性也随之消失(图4).产生这种结果的原因,既不是由于1-MCP本身对水稻挥发物的影响(图5),也不是由于1-MCP影响了褐飞虱的取食而导致了挥发物的改变.这些研究结果说明,乙烯信号途径在褐飞虱为害诱导的水稻挥发物的合成中起着重要作用.迄今为止,已在几种植物中报道了植食性昆虫为害会导致植物乙烯释放量的增加[25～27,38,39].从这些结果中可以明确,在不同植物中,植食性昆虫为害诱导的乙烯释放过程及其在挥发物释放中的作用是不同的.例如,玉米在受甜菜夜蛾Spodopteraexigua攻击时,乙烯的释放是缓慢的(比挥发物的释放时间迟),并依赖于光周期;同时,乙烯可以增强挥发物诱导素(volicitin)和茉莉酸诱导的挥发物的释放,但对机械损伤没有增强作用.相反地,烟草Nicotianaattenuata在受植食性昆虫为害时,能迅速地释放乙烯,并且乙烯的释放似乎与光周期无关,也不影响挥发物的释放.本研究结果表明,褐飞虱为害亦能迅速地增加水稻的乙烯释放量,这与在烟草N.attenuata中的研究结果相类似.此外,本研究还证实了乙烯信号转导途径在褐飞虱为害诱导的水稻挥发物的合成与释放中发挥着重要作用(图2和3,表1和2),并且与在玉米、烟草和利马豆等植物中所发现的作用不同,说明在不同的植物-植食性昆虫系统中,乙烯信号转导途径在虫害诱导的植物挥发物的合成中起着不同的作用.为了确定外用乙烯利在水稻挥发物释放中的作用,本研究测定了一系列的乙烯利浓度和处理时间.结果表明,0.5mmol/L乙烯利处理24h,1mmol/L处理12h,2mmol/L处理6或12h能诱导水稻释放引诱寄生蜂的挥发物(表1).然而,值得讨论的一个问题是,这些处理中所用的乙烯浓度是否接近水稻本身产生的生理浓度.当乙烯利水溶液的pH在4以下时比较稳定,而当pH高于4时乙烯利会分解为乙烯、磷酸和氯离子.乙烯利水溶液的半衰期依赖于水溶液的pH和温度.例如,当水溶液的pH为7.0,温度分别为10℃和35℃时,乙烯利的半衰期分别为100和4h.本研究中乙烯利水溶液的pH为7.2,温度为28℃.假如乙烯利溶液的半衰期和温度之间以及乙烯的释放量与时间之间呈线性关系,则2mmol/L乙烯利处理在6h时容器中的乙烯浓度为17.4µL/L(为6h/38h×110µL/L;乙烯利在28℃时的半衰期为38h,到半衰期时容器中的乙烯浓度为110µL/L).这大约是在褐飞虱为害稻株中所测到的最高浓度(为害22h时)的170倍.然而,需要说明的是,本研究所测到的乙烯浓度是从植物中释放到容器中的浓度,而事实上在植物叶片的表面层(5mm厚)和内部,乙烯的浓度要远大于植物所释放到空间中的因此,尽管我们现在无从知道水稻表面层和内部的真正乙烯