小半夏加茯苓汤高效液相色谱条件考察及复方止呕效用成分的特征图谱方法学研究

小半夏加茯苓汤高效液相色谱条件考察及复方止呕效用成分的特征图谱方法学研究

东汉著名艺术家张仲景创造的“缺钱”。千百年来,该方被广泛用于治疗各种原因引起的呕吐,疗效显著。研究还表明复方小半夏加茯苓汤具有抑制肝癌、胃癌等肿瘤细胞的生长和增殖。近期研究发现家鸽呕吐潜伏期、呕吐次数与总生物碱质量分数呈良好线性关系,且相关性极显著。单味药药效研究表明:半夏中总生物碱及鸟苷具有止呕药效;生姜中姜酚类成分6-Gingerol(6-姜酚)、8-Gingerol(8-姜酚)和10-Gingerol(10-姜酚)为其止呕药用主要成分;茯苓中茯苓三萜类成分茯苓酸及去氢茯苓酸具有止呕药效。单味药效成分的分析方法已有较多的研究,而复方效用物质基础研究,特别是复方药效成分谱效关系研究很少文献报道。我们的工作主要是利用高效液相色谱仪(HPLC)分析手段,建立复方小半夏加茯苓汤药效成分的特征图谱,以期为中药复方HPLC图谱与止呕药效关系的研究提供理论基础。1实验材料1.1仪器、药品、仪器高效液相色谱仪(ShimadzuLC-20AT);二元泵,二极管阵列检测器(PDA);色谱工作站(Lc-solution);AG135型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);旋转蒸发仪;水浴锅;SHZ-Ⅲ型循环水真空泵;CH-250型超声波清洗机(天津恒奥科技公司,功率250W,频率33kHz)。鸟苷、盐酸麻黄碱(中国药品生物制品检定所);6-姜酚、10-姜酚(天津马克生物技术有限公司);8-姜酚(天津化标生物技术有限公司);芦丁、茯苓酸、去氢茯苓酸(南京泽朗医药科技有限公司);色谱乙腈、色谱甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司);水(乐百氏纯净水);磷酸(优级)。1.2实验材料生半夏购于贵州赫章县半夏生产基地,生姜购于贵州长顺县生姜生产基地,茯苓购于贵阳市花果园药材批发市场。1.3样品的制备1.3.1去氢茯苓酸溶液配制精密称取鸟苷、盐酸麻黄碱、芦丁、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、茯苓酸及去氢茯苓酸适量用色谱甲醇定容,制成1.00mg/mL鸟苷、3.57mg/mL盐酸麻黄碱、1.00mg/mL芦丁、1.00mg/mL6-姜酚、1.00mg/mL8-姜酚、1.00mg/mL、10-姜酚、1.13mg/mL茯苓酸、1.13mg/mL去氢茯苓酸储备液。1.3.2标准工作溶液的配制分别移取盐酸麻黄碱1mL,6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、鸟苷、茯苓酸及去氢茯苓酸各0.5mL,芦丁0.25mL到5mL的容量瓶中用甲醇稀释到刻度,制成含鸟苷0.10mg/mL、6-姜酚0.10mg/mL、8-姜酚0.10mg/mL、10-姜酚0.10mg/mL、茯苓酸0.11mg/mL、去氢茯苓酸0.11mg/mL、含麻黄碱0.71mg/mL、芦丁0.05mg/mL的混合标准溶液。1.3.3乙醇提取物的制备取生半夏6g,茯苓3g,另将生姜切碎,称取5g,置于500mL圆底烧瓶中,加入8倍量的50%乙醇(112mL)于85℃水浴锅中提取,溶剂沸腾开始计时,提取2h,过滤;残渣再加入8倍量50%乙醇同条件提取,过滤,合并两次滤液,摇匀,用微孔滤膜过滤,备用。2方法与讨论2.1复方提取、制备及核心样品测定8种检测成分中,鸟苷、麻黄碱、芦丁易溶于水,姜酚、茯苓酸及去氢茯苓酸脂溶性较大,为使复方提取液HPLC图谱中各成分响应值较均匀,考察了复方水提、50%乙醇提取及95%乙醇提取三者之间图谱差异(图1),并得出3种提取方法中8种止呕效用成分含量(表1)。2.2色度条件的选择2.2.1色谱柱对复方分离的影响为使复方8种效用成分达到较佳分离效果,考察了DiamonsilC8、DiamonsilC18、ShimadzuC18、PhenomenexC184种色谱柱对复方分离的变化(表2所示)。样品为50%醇提复方;236nm检测波长;40℃柱温;流动相A相为乙腈,B相为0.1%磷酸水,0.01min→B相为99%,65min→B相为5%,75min→B相为0%,梯度洗脱,所得色谱图如图2所示。2.2.2洗脱流动相0.1%为筛选较佳洗脱流动相,分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸水(0.1%)、乙腈-磷酸水(0.1%)、乙腈-甲酸水(0.1%)、乙腈-三乙胺水(0.02%)6种洗脱流动相。样品为50%醇提复方;色谱条件为:PhenomenexC18色谱柱;236nm检测波长;40℃柱温;流动相A相为有机相,0.01min→B相为99%,65min→B相为5%,75min→B相为0%,梯度洗脱,所得色谱图如图3所示。2.2.3种效用成分混合标准液的色谱图8种效用成分中,盐酸麻黄碱最大吸收波长为206nm,去氢茯苓酸、茯苓酸最大吸收波长为241nm,鸟苷、芦丁最大吸收波长为254nm,6-姜酚、8-姜酚及10-姜酚最大吸收波长为280nm。为使色谱图中8种成分响应值基本均匀,试验考察了8种效用成分混合标准液在206nm、236nm、254nm及280nm4个波长处的图谱差异(图3)。样品为50%醇提复方;色谱条件为:PhenomenexC18色谱柱;40℃柱温;流动相A相为乙腈,B相为0.1%磷酸;洗脱梯度如表3所示。2.2.4色谱条件筛选提取条件筛选中,从不同提取方法的图谱差异(图1)及三种提取方法中8种效用成分含量比较(表1)可以看出:水提复方中,鸟苷、麻黄碱含量相对较高;95%乙醇提取复方姜酚类含量较高;50%乙醇提取复方中各成分含量较均匀。因此,综合考虑各指标成分的色谱考察条件,本试验选用50%乙醇提取作为复方提取溶剂。色谱柱的筛选,从四种色谱柱所分离色图谱(图2)可以看出:出峰数目、保留时间等均不一致,其中PhenomenexC18色谱柱相对来说有较好的分离效果,且能保证有较好的稳定性和重现性,故选做分离复方所用色谱柱。洗脱流动相筛选,从6种流动相所分离复方色谱图比较(图3)可以看出:甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸水(0.1%)所分离的复方图谱均较良好,其中乙腈-磷酸水(0.1%)分离效果最佳,因此选择乙腈-磷酸水(0.1%)系统作为复方洗脱流动相。检测波长筛选,从混合标准溶液在4个波长处色谱图的比较(图4)显示:在206nm处,因受流动相影响,复方图谱分离度较差;在280nm处,麻黄碱响应值较低;254nm检测,姜酚类成分响应值太低;236nm波长检测,各对照峰之间响应值较均匀,因此选择波长236nm作为复方检测波长。综上所述,最终确定测定复方8种止呕效用成分的色谱条件为:PhenomenexGeminiC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相A相为乙腈,B相为0.1%磷酸水,洗脱梯度见表3;柱温40℃;检测波长236nm;流速1mL/min。最终色谱图谱如图5所示。2.3方法研究2.3.1含鸟苷的0.0.ml,需要做什么?精密吸取混合标准液适量,用色谱甲醇稀释,浓度分别为:(1)含鸟苷0.100mg/mL、6-姜酚0.100mg/mL、8-姜酚0.100mg/mL、10-姜酚0.100mg/mL、茯苓酸0.110mg/mL、去氢茯苓酸0.110mg/mL、麻黄碱0.710mg/mL、芦丁0.050mg/mL;(2)含鸟苷0.050mg/mL、6-姜酚0.050mg/mL、8-姜酚0.050mg/mL、10-姜酚0.050mg/mL、茯苓酸0.055mg/mL、去氢茯苓酸0.055mg/mL、麻黄碱0.355mg/mL、芦丁0.025mg/mL;(3)含鸟苷0.025mg/mL、6-姜酚0.025mg/mL、8-姜酚0.025mg/mL、10-姜酚0.025mg/mL、茯苓酸0.028mg/mL、去氢茯苓酸0.028mg/mL、麻黄碱0.178mg/mL、芦丁0.013mg/mL;(4)含鸟苷0.013mg/mL、6-姜酚0.013mg/mL、8-姜酚0.013mg/mL、10-姜酚0.013mg/mL、茯苓酸0.013mg/mL、去氢茯苓酸0.014mg/mL、麻黄碱0.089mg/mL、芦丁0.006mg/mL;(5)含鸟苷0.006mg/mL、6-姜酚0.006mg/mL、8-姜酚0.006mg/mL、10-姜酚0.006mg/mL、茯苓酸0.006mg/mL、去氢茯苓酸0.007mg/mL、麻黄碱0.045mg/mL、芦丁0.003mg/mL;(6)含鸟苷0.003mg/mL、6-姜酚0.003mg/mL、8-姜酚0.003mg/mL、10-姜酚0.003mg/mL、茯苓酸0.003mg/mL、去氢茯苓酸0.004mg/mL、麻黄碱0.023g/mL、芦丁0.002mg/mL的系列标准溶液,以上系列标准溶液在2.2.4项色谱条件下进样20μL,以峰面积积分值为纵坐标,进样量(μg)为横坐标制作标准曲线,回归方程及线性范围见表4。2.3.2重复进样6次分别精密移取稀释后的混合标准储备液适量,在2.2.4项色谱条件下进样20μL,重复进样6次。鸟苷、盐酸麻黄碱、芦丁、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、去氢茯苓酸、茯苓酸峰面积积分值的RSD分别为0.79%、0.87%、0.61%、0.81%、0.65%、0.74%、0.54%、0.76%,表明仪器精密度良好(图6)。2.3.3重复性试验ld分别按2.2项方法提取6份复方提取液,按5项色谱条件进样20μL,鸟苷、盐酸麻黄碱、芦丁、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、去氢茯苓酸、茯苓酸峰面积积分值的RSD分别为0.65%、0.71%、0.90%、0.56%、0.49%、0.80%、0.90%、0.93%,表明试验重复性良好(图7)。2.3.4去氢茯苓酸、去氢茯苓酸峰面积积分值rsd取同一供试溶液,分别于制样后0,2,4,8,12,24h,按2.2.4项色谱条件进样20μL,鸟苷、盐酸麻黄碱、芦丁、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、去氢茯苓酸、茯苓酸峰面积积分值的RSD分别为1.25%、0.96%、0.83%、1.04%、0.92%、1.07%、0.77%、0.82%,表明供试品溶液在24小时内稳定(图8)。2.3.5去氢茯苓酸、茯苓酸回收率分别取已知含量的同一个供试样品9份,分为3组,每组精密加入高、中、低3个浓度的混合标准溶液,按2.2.4项色谱条件进样20μL,鸟苷、盐酸麻黄碱、芦丁、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、去氢茯苓酸、茯苓酸回收率分别为:98.33%、97.26%、97.81%、96.60%、98.01%、97.09%、96.46%和95.90%;RSD分别为:1.0%、1.3%、1.1%、1.3%、1.3%、1.3%、1.0%和