胶柱层析对生姜精油中-水芹烯的分离研究

胶柱层析对生姜精油中-水芹烯的分离研究

姜油提取主要包括生姜、生姜、碱性物质、非药物烯、甘草烯、二苯基、三氟水胺、三氟水胺和姜酚。每一种物质都具有一定的活性和良好的应用价值。β-水芹烯是存在于花椒、生姜等植物的挥发油中的单环单萜类化合物,含有一个共轭双键,化学性质活泼,具有新鲜的柑橘-胡椒香气,是一种香料和香料中间体,同时也是一种具有生物活性的天然杀虫剂。β-水芹烯在各植物油中的含量均不高,国内外学者对β-水芹烯的研究以合成居多,如夏克坚等以β-蒎烯为原料,经磺化、裂解等反应制备出β-水芹烯;任宇红等采用微波裂解,使β-水芹烯的合成路线缩短;EdwardL.Handl等在合成中,采用多级萃取结晶方法,使β-水芹烯与多种萜烯分离。β-水芹烯可作为高档香料和药理活性物质,就这两方面而言,天然产品更有优势,但目前尚未有从天然产物中分离β-水芹烯的资料可供借鉴。另外,从生姜精油中分离姜酚和姜烯的过程中,β-水芹烯往往都被舍弃。因而,有必要对生姜精油中β-水芹烯的分离进行研究。硅胶柱层析技术具有分离速度快、效率高、分离效果明显等特点,被广泛应用于生物活性物质的分离研究,也可应用于小规模工业化生产。作者采用此法较好地分离了姜烯,在此基础上,对β-水芹烯的分离进行了研究。采用紫外分光光度法(UV)和气质联用法(GC-MS)作为主要分析方法,高效液相色谱(HPLC)分析作为辅助,利用两次硅胶柱层析将β-水芹烯与姜烯、姜酚等完全分离。1实验部分1.1高效液相色谱仪;HP6890N-5972NMSD气相色谱-质谱联用色谱仪,美国Agilent公司;Agilent1100高效液相色谱仪,美国Agilent公司;TU-1901型双光束紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限公司;加压泵;玻璃层析柱2根,Φ22mm×740mm,自制。生姜精油(超临界CO2萃取),南阳张仲景大厨房股份公司;柱层析硅胶,200～300目,青岛海洋化工厂;乙醇、乙醚、正己烷:AR,天津市广成化学试剂有限公司。1.2方法1.2.1柱净化和洗脱剂的制备将层析硅胶在105℃下活化2h。取生姜精油,加乙醇溶解,再加适量活化硅胶,搅拌均匀后去除溶剂,得到吸附有生姜精油的硅胶。采用干法装柱,活化硅胶一次性加入玻璃层析柱中,吸附有生姜精油的硅胶置于其上。选择乙醚和正己烷作为洗脱剂进行洗脱,以加压的方式控制流速,每段洗脱液4.0mL,分装备测。同时,另一层析柱在相同条件下做平行实验,实验测定分离条件对分离效果的影响。在最优分离条件下,将含有β-水芹烯的样品富集、浓缩后,进行第二次硅胶柱层析分离实验,得到β-水芹烯样品。1.2.2gc-ms分析将硅胶柱层析实验所得各段洗脱液样品进行UV跟踪分析,在波长233nm、265nm(姜烯)和波长281nm(姜酚)下进行吸光度测量,将样品的UV分析数据绘图,得到各段洗脱液的吸光度洗脱段编号曲线。将生姜精油和得到的β-水芹烯样品进行GC-MS分析。色谱条件:起始温度60℃,以10℃/min速率升温至120℃,以5℃/min速率升温至270℃,停留50min。进样口温度为280℃,分流比20∶1;载气为氦气,流速为1mL/min,传输线温度为270℃。质谱条件:电离方式为电喷雾电离(EI),电子能量70eV,离子源温度为240℃。将生姜精油和得到的β-水芹烯样品进行HPLC分析。色谱条件为:流动相:甲醇-水,梯度洗脱,检测器:DAD,检测波长:233nm,扫描波长范围:190～400nm,柱子:ODS柱,自动进样。2结果与讨论2.1c.其为生物树的测定,其树立了其符合乙烯体积分数洗脱剂的选择和组成是硅胶柱层析的关键。首先通过实验对洗脱剂中乙醚的体积分数进行了分段讨论,发现当乙醚含量较低时,可分离出生姜精油中的烯类成分,而姜酚等不能洗脱。当乙醚体积分数<5%时,可将烯类成分进一步分离,这是因为乙醚体积分数<5%时,乙醚在洗脱剂中起稀释剂作用。图1、2分别为洗脱剂中乙醚体积分数5%和不含乙醚的各段洗脱液的吸光度曲线。m(生姜精油)∶m(硅胶)=1∶25。由图1可见,乙醚体积分数为5%时,生姜精油中的烯类可分离为3种,经GC-MS分析,主要成分依次为β-水芹烯、姜烯和α-姜黄烯,其中后两种烯分离较充分。当不含乙醚(只有正己烷)时,只分离出前两种烯,分别主要为β-水芹烯和姜烯(下文洗脱曲线中第1个峰为β-水芹烯峰,第2个峰为姜烯峰)。虽然乙醚体积分数5%的洗脱剂可分离出3种烯类,但目标物β-水芹烯的分离不如只有正己烷的洗脱剂分离效果好,且乙醚极易挥发,故选择正己烷作为洗脱剂。2.2测定m生姜精油m硅胶生姜精油与硅胶的质量比也是影响分离效果的重要因素,图3、4分别为m(生姜精油)∶m(硅胶)=1∶25和1∶50的分离曲线,洗脱剂为正己烷。当m(生姜精油)∶m(硅胶)=1∶50时,分离曲线在峰的精细度和分离效果两方面都较好,而m(生姜精油)∶m(硅胶)=1∶25时,两类烯的分离效果较差,这是因为,样品的过载会使硅胶柱的分离效能成指数下降。一般来说,上样量越少,硅胶柱分离效果越好,考虑硅胶的利用率,选择m(生姜精油)∶m(硅胶)=1∶50。2.3洗脱溶剂的选择由于硅胶细密,洗脱剂在硅胶柱中的流速一般较小,图5、6是洗脱剂流速分别为1.0mL/min和2.0mL/min的分离曲线,其他条件:m(生姜精油)∶m(硅胶)=1∶50,洗脱剂为正己烷。洗脱剂流速为2.0mL/min时两类烯分离得更加充分,这是因为:色谱柱的理论塔板高度H与流动相在色谱柱的线速度U之间成凹型曲线关系,只有当流动相在色谱柱中的线速度达到一定值时才具有最佳柱效,可见适当提高流速有利于两者的分离,且洗脱时间大为缩短,故选择流速为2.0mL/min进行洗脱。图3～6中,第一洗脱峰样品中主要含β-水芹烯,第二洗脱峰样品中主要含姜烯。2.4峰面积百分数将生姜精油和得到的β-水芹烯样品作GC-MS分析,两个样品的总离子流色谱图和主要化学成分及峰面积百分数分别见图7和表1。由表1可以看出,①β-水芹烯样品中主要含有莰烯和β-水芹烯等单萜类成分,而不含有姜烯等倍半萜成分,化学成分远少于生姜精油中的10种,分离效果较好。②目标物β-水芹烯得到有效富集,峰面积百分数达到95.18%,同时,莰烯的含量也有较大幅度提高。2.5高效液相色谱图将生姜精油和β-水芹烯样品作HPLC分析,图8为三维高效液相色谱图。可以看出,生姜精油的三维HPLC色谱图吸收峰数目较多,成分复杂,而β-水芹烯样品的三维HPLC色谱图只有一个杂质峰,说明分离效果较好。2.6加生姜精油回收率利用得到的β-水芹烯样品和生姜精油的GC-MS分析数据,计算β-水芹烯的回收率:其中,A1:β-水芹烯单位体积样品中β-水芹烯峰面积计数;V1:β-水芹烯样品体积,mL;A2:生姜精油单位体积样品中β-水芹烯峰面积计数;V2:上样生姜精油体积,mL。经计算,β-水芹烯的回收率为65.38%。3酶处理条件优化以超临界CO2萃取的生姜精油为原料,对硅胶柱层析法分离其中的β-水芹烯的条件进行了讨论,结果表明