乌梅白凤丸对动脉粥样硬化大鼠血管内皮细胞凋亡的影响

乌梅白凤丸对动脉粥样硬化大鼠血管内皮细胞凋亡的影响

女性进入更年期后，由于卵巢机制的衰退和雌激素水平的降低，导致脂肪和胆固醇的异常代谢，以及动脉样本硬化（as）的形成。我们早期的研究发现乌鸡白凤丸对脂代谢紊乱有明显的调整作用,为进一步研究乌鸡白凤丸防治动脉粥样硬化的血管损伤的机制,本实验采用高脂饲料喂养法建立大鼠早期动脉粥样硬化模型,探讨乌鸡白凤丸有效成分对血管内皮细胞凋亡的影响。1材料和方法1.1乙醇超声提取法乌鸡白凤丸(9g/丸),药都制药集团股份有限公司提供,用80%乙醇超声提取器中提取两次,每次两小时,减压浓缩至2g生药/ml备用;吉非罗齐,保定市古城药厂,批号040625,实验前用CMC配制浓度为0.016g/ml溶液备用。1.2实验动物及饲料SD大鼠清洁级,体重180～200g,雄性,由河北省实验动物中心提供,许可证号为SCXK(冀)2003-1-003,动物饲料亦由该中心提供。1.3试剂TC、TG、LDL、HDL试剂盒,日本协和株式会社提供;Caspase-3兔抗人多克隆抗体,由美国SantaCruz公司提供。1.4仪器全自动生化分析仪(瑞士);Epics-XLⅡ型流式细胞仪,美国BeckmanCoulter公司。1.5血管内皮凋亡及caspase-3活性的检测大鼠随机分为5组,除正常对照组外,其余各组采用高脂饲料(2%胆固醇、0.5%胆酸钠、10%猪油、0.02%他巴唑、普通饲料87.48%)喂养,同时灌胃乌鸡白凤丸或吉非罗齐混悬液,模型对照组和正常对照组给予等容量的自来水,连续10周。给药10周后,各组大鼠禁食12小时,乙醚麻醉,眶后静脉取血,分离血清,全自动生化分析仪测定TC、TG、LDL、HDL水平;各组随机取6只大鼠,剖取胸主动脉约2cm长,剥取内膜,70%乙醇固定,制备单细胞悬液,碘化丙啶染色,同时设阴性对照,以替代一抗,阳性对照只加一抗或只加二抗,流式细胞仪检测血管内皮细胞的凋亡及Caspase-3的蛋白表达,数据采集为对数(log)方式,应用Expo32ADC进行免疫荧光数据分析。计数10000个细胞,计算凋亡率(AP)。AP=凋亡细胞数细胞总数×100%AΡ=凋亡细胞数细胞总数×100%用MuticycleAV分析软件对DNA细胞周期拟合分析,计算出DNA组方图各时相分布的百分比,以增殖指数(PI)表示细胞的增殖活性:PI=S+G2/MG0/G1+S+G2/M×100%ΡΙ=S+G2/ΜG0/G1+S+G2/Μ×100%2结果2.1大鼠脂代谢应从结果可见,模型对照组大鼠血清TC、TG、LDL、HDL均较正常对照组大鼠升高,表明大鼠连续10周喂养高脂饲料,已造成大鼠脂代谢紊乱。乌鸡白凤丸及阳性对照药组大鼠血清TC、TG、LDL均较模型组显著降低,见表1。2.2率、caspase-3的表达情况Caspase-3蛋白表达的影响结果模型对照组大鼠主动脉内皮细胞的凋亡率、Caspase-3的蛋白表达量显著高于正常对照组,增殖指数明显低于正常对照组;乌鸡白凤丸大鼠主动脉内皮细胞的凋亡率及Caspase-3蛋白表达量较模型对照组大鼠降低,而增殖指数较模型对照组大鼠增高,见表2。3细胞凋亡的形成AS的发病有明显的性别差异,育龄期妇女发生率明显低于男性,但妇女绝经后这一差异逐渐消失,由此推测绝经前妇女体内具有某种保护因素,使其免受AS的侵袭。现今,这种保护因素被认为是雌激素。中西医结合对肾本质的研究表明,肾虚时有下丘脑-垂体-性腺轴的功能减退,雌激素分泌减少。乌鸡白凤丸具有滋补肝肾,调补气血之功,尤重填补肾精,为乌鸡白凤丸防治妇女绝经后AS提供了中医理论依据。近几年发现细胞异常凋亡在多种心血管疾病的发生与发展中起重要的作用,特别是在高脂血症斑块中发现内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞都经历着凋亡与坏死,而凋亡占主导地位,参与AS的形成过程。细胞凋亡在AS斑块中明显加剧,出现大量细胞凋亡与细胞增殖,组成AS斑块的病理基础。大量研究也证实了人类AS斑块中存在细胞凋亡。由于凋亡细胞在体内存在时间极短,低比例的凋亡发生即意味着大量的细胞凋亡已经发生。Caspase-3属于半胱氨酸蛋白酶,相当于线虫中的ced-3,在破坏细胞骨架结果方面有重要作用,这些蛋白酶是引起细胞凋亡的关键酶,一旦被信号途径激活,能将细胞内的蛋白质降解,使细胞不可逆的走向死亡。因此,若能控制该酶的活性对凋亡的结局可产生重要影响。本实验采用高脂食饲法造成大鼠早期动脉粥样硬化模型,我们在实验中发现模型对照组大鼠较正常对照组大鼠主动脉内皮细胞凋亡率明显升高,增殖指数明显降低,Caspase-3的蛋白表达也明显升高;应用乌鸡白凤丸后,主动脉内皮细胞Caspase-3的蛋白表