广西产两面针液质联用指纹图谱研究

广西产两面针液质联用指纹图谱研究

两个面针zanhoxylumnitidum（roxb.）d.是培育类青椒的干燥根。味辛、苦、微温,小毒,具有祛风通络、胜湿止痛、消肿解毒抗菌、抗癌等作用。近年来,两面针药材资源开始出现匮乏,市售药材根茎混用现象严重,出现了较多伪品,常见的有同科属的竹叶椒Zanthoxylumarmatum.DC,同科飞龙掌血属的飞龙掌血ToddaliaasiaticaLam.等,影响了药材的质量。对于两面针药材质量的控制,中国药典和文献报道多为以氯化两面针碱为指标性成分并进行含量测定。颜玉贞等建立了两面针LC/UV色谱指纹图谱,对药材的质量评价具有较好的指导意义。本文拟报道应用液质联用仪建立两面针的LC/MS指纹图谱,利用质谱的定性功能对指纹图谱中的共有峰进行峰的归属,以完善两面针的指纹图谱,并将两面针与两面针茎部位,飞龙掌血、竹叶椒进行了比较,为两面针药材的进一步鉴别提供依据。1仪器和试剂盒1.1仪器、试剂与仪器TSQQuantumAccess液质联用仪,配Surveyor自动进样器,Xcalibur2.0色谱工作站(ThermoFisher公司,美国),Millipore-Q超纯水仪(MilliporeCorporation,美国),KQ-700DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司),BS224S型电子天平(赛多利斯,北京)。1.2植物碱对照品氯化两面针碱对照品(批号:110848-200502),白屈菜红碱对照品(批号:111718-200501),均购自中国药品生物制品检定所。木兰碱对照品(批号:100107),购自上海融禾医药科技发展有限公司,含量>98%。乙腈、甲醇(色谱纯,Merck)、甲酸(色谱纯,Dikma)、超纯水(自制);甲醇(AR,广州化学试剂厂),氨水(AR,广州化学试剂厂)。试验中所用的15批两面针药材均采自广西地区,见表1。经广州中医药大学詹若挺研究员鉴定为芸香科花椒属植物两面针Zanthoxylumnitidum(Roxb.)DC.的干燥根。2方法和结果2.1试验条件色谱柱:AgilentZorbaxEclipseC8(2.1mm×100mm,3.5μm);流动相:甲醇(A)-乙腈(B)-0.5%甲酸(C)(氨水调pH=4.5)梯度洗脱:0~25min:A(5%~15%),B(5%~15%),C(90%~70%);25~50min:A(15%~30%),B(15%~30%),C(70%~40%);50~65min:A(30%~45%),B(30%~45%),C(40%~10%);70min:A=45%,B=45%,C=10%。流速:0.3mL/min;柱温:25℃;离子源:大气压电喷雾离子源(ESI);正离子检测模式;喷雾电压:3500V;鞘气压力:35psi;辅助气压力:5arbitraryunits;金属离子传输毛细管温度:350℃;扫描模式:全扫描和子离子全扫描;扫描范围:180~900m/z。2.2对照品溶液的制备取经P2O5真空干燥过夜的氯化两面针碱,白屈菜红碱,木兰碱对照品适量,精密称定,加甲醇分别制成每1mL含19.66μg,14.94μg和15.14μg的溶液,作为对照品溶液备用。2.3同法超声处理工艺流程将药材粉碎,过三号筛。取粉末约1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加70%甲醇20mL,超声处理(功率:280W,频率40kHz)30min,放冷,滤过,滤液置50mL量瓶中,滤渣和滤纸再加70%甲醇20mL,同法超声处理30min,放冷,滤过,滤液置同一量瓶中,加适量70%甲醇洗涤2次,洗液并入同一量瓶中,加入70%甲醇至刻度,摇匀,0.22μm微孔滤膜滤过,即得。2.4色谱图的测定精密吸取供试品溶液4μL,注入液质联用仪,记录70min的色谱图,梯度平衡12min。数据处理采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004年A版(国家药典委员会)。2.5菜红碱及两面针的稳定性试验精密吸取空白溶液(70%甲醇)、对照品木兰碱、氯化两面针碱、白屈菜红碱及两面针供试品溶液各4μL,分别注入液质联用仪,按前述色谱条件进行分析,记录总离子流图(图1)。空白溶液基本不干扰样品的测定,但RT=62min处有一小峰,其干扰可利用空白背景扣除来消除。2.6各峰相对峰面积srd取同一份两面针药材的供试品溶液,连续进样6次,比较共有峰的相对保留时间,相对峰面积。结果表明,共有峰的相对保留时间RSD<3%,相对峰面积RSD<5%。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004年A版进行相似度计算,6张总离子流图的相似度>0.99,表明仪器精密度良好。2.7共有峰相对保留时间和相对峰面积取同一份两面针的供试品溶液,分别在制备后的0,2,4,8,16,24,36,48h进样,比较各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。结果表明共有峰的相对保留时间RSD<3%、相对峰面积RSD<5%。同上法计算相似度,结果8张总离子流图的相似度>0.99,表明供试品在48h内稳定。2.8各峰保留时间及相对峰面积取同一批两面针样品6份,制备供试品溶液,比较各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。结果表明共有峰的相对保留时间RSD<2%、相对峰面积RSD<5%。同上法计算相似度,结果6张总离子流图的相似度>0.99,表明本方法重复性较好。2.9指纹谱共同模式的建立2.9.1指纹图谱的共有模式15批两面针药材的总离子流图如图2所示。将15个图谱进行匹配,以图谱中峰面积较大,峰形较好,其保留时间为33.14min的白屈菜红碱色谱峰为参照峰,用相对保留时间来标定共有指纹峰。结果表明1~22号峰在15批样品中均出现,而且相对保留时间较为稳定,RSD小于6%。因此,标定此22个色谱峰为共有指纹峰。利用中位数法得到了广西产两面针LC/MS指纹图谱的共有模式,见图3。通过与标准品的比较,可以确定编号为2、11、12的3个共有峰分别为木兰碱,氯化两面针碱和白屈菜红碱;利用文献检索,综合化合物结构,准分子离子峰和二级质谱碎片离子信息等,对其中的9个共有峰可能对应的化合物进行了推测。各共有峰的相对保留时间及质谱信息见表2。2.9.2相似度检验采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004年A版进行相似度计算,结果15批药材与共有模式相比相似度均在0.90以上,说明样品间相似度较高。2.10针和假针之间的比较2.10.化学成分测定同法处理两面针的茎部位,通过质谱信息比较,发现两面针根和茎的化学成分基本一致,但茎中的主要生物碱含量较低,尤其是氯化两面针碱和白屈菜红碱(保留时间分别为31.56min,33.14min),这与既往的研究结果一致,见图4。2.10.两种针的比较同法处理8批飞龙掌血和13批竹叶椒。通过质谱信息比较,发现飞龙掌血与两面针含有部分相同的化学成分,如木兰碱,氯化两面针碱,白屈菜红碱等,二者的主要区别在于图谱的后半部分,极性较小成分存在差异。且飞龙掌血含有特征性成分毛两面针素,其保留时间为29.90min,可以将飞龙掌血与两面针区分开来。竹叶椒则含有共有成分木兰碱和白屈菜红碱,但含量较低,基本上检测不到两面针中的指标性成分氯化两面针碱,借此可以将竹叶椒和两面针区分开来,见图5。将得到的飞龙掌血和竹叶椒的图谱分别导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004年A版,以得到的两面针LC/MS指纹图谱共有模式为参照图谱,计算相似度,飞龙掌血与两面针的相似度均小于0.65,竹叶椒与两面针的相似度均小于0.55。3色谱检测结果3.1实验对不同浓度的提取溶剂(70%甲醇,100%甲醇),提取次数(1次,2次)进行考察,70%甲醇超声提取两次峰形较好,各峰达到基线分离,效果最佳。3.2两面针药材所含化学成分较多且结构相近,采用等度洗脱很难将色谱峰分开。故本实验中采用梯度洗脱以实现其良好的分离。考察了不同流动相系统:甲醇-0.1%甲酸,乙腈-0.1%甲酸,甲醇-0.5%甲酸,乙腈-0.5%甲酸,甲醇-乙腈-0.5%甲酸等流动相系统和梯度洗脱程序。结果表明,甲醇-乙腈-0.5%甲酸洗脱系统分离的色谱峰分离度较好,峰型对称,基线平稳,保留时间适中。3.3在检测的15批广西产两面针药材中,各批样品指纹图谱重现性较好,与共有模式的相似度也较高,说明了LC/MS指纹图谱是可以考虑用于两面针的质量控制和真伪评价的。另一方面,相同采收期相同采收地所收集的样品相似度很高,而不同采收期不同采收地样品的相似度略低,主要体现在各共有峰的相对峰面积差异较大,说明两面针药材中的化学成分的含量受地理环境,气候条件及采收季节的影响,因此,建立两面针的规范化种植基地,对于保证两面针药材的质量稳定是非常必要的。3.4借助本研究建