猪人工授精新技术的研究进展

猪人工授精新技术的研究进展

1射精过程的精子特性及影响因素体内授精部位的精卵比例是相同的，即使在祖母怀孕之前也是如此。然而,需要非常多的精子才能使母猪成功怀孕,自然交配时公猪射入母猪子宫颈管的精子数为50×109个,这么多的精子数将有助于活力较强的精子克服母猪子宫内部的阻力,从而快速到达受精部位。与自然交配时精子射入的数量相比,人工授精时要想达到高的妊娠率就必须面对这样一个问题,即母猪获得高妊娠率时所需的最小输精剂量。最近在讨述如何降低猪人工授精的精子剂量时,主要介绍如何利用现有输精技术减少授精的精子数。然而,卵母细胞受精所要求的最低精子数不仅取决于人工输精技术,而且还受其他因素的影响,它们包括精子的受精能力和母猪的身体状况。自然交配时,公猪射精后将精液储存在母猪子宫颈管内,其中的精子会通过移动迅速进入子宫内和子宫角。公猪一次射精的精子含量高达50×109~70×109个,并带入大量的精浆(250~400mL),以扩张母猪的子宫和子宫角。众所周知,由于授精后有部分精液在生殖道内会产生倒流,造成25%~40%或是更多的精液浪费掉。剩余的精液除了小部分能到达受精位点外,其余的均被多形核白细胞(PolyMorphonuclearLeukocyte,PMN)作为由精浆和精子引发的炎症应答所吞噬。中性白细胞在受精后0.5~3h进入子宫腔内,这可能是受高水平的雌性激素刺激所致。伴随着中性白细胞进入子宫腔的还有巨噬细胞和树突细胞,但是粒细胞和淋巴细胞似乎粘附在子宫内膜基质上。损失的数十亿精子很显然不是没有原因的,并且只有那些最终能到达卵母细胞的精子才会被接受。众所周知,公猪每次射出的精液存在着异质性,且通常和精子的成熟度或内部的遗传特性有关;每次射出的精液在精子形态学、鞭毛活性等等方面都有很大差异。此外,精子进入输卵管很大程度上是一个选择性的过程,这主要取决于每个精子固有的运动能力。由于运动能力是精子的特性,此特性也是选择精子的最佳机制。能进入输卵管的相对精子数上的差异随公猪的不同而不同,甚至是来自不同公猪的含有相同精子数的精液在这方面也不同。能获得最大受精率的最小精子数不仅取决于公猪,而且也取决于授精前所用精液的操作过程。冷冻-冻融过程、流式分选操作或分期射精都会弱化精子,影响它们在雌性生殖道中的生存能力和存活时间,因此能够到达输卵管的精子数要少于新鲜精液。此外,另一个缩短精子寿命的因素是精子质膜周围精液浆的减少,这是由于高倍稀释所致。射精时出现的精浆主要影响精子的生理学特性,增强射精后精子的运动能力和膜的稳定性。在高倍稀释的精子中添加精浆能增强精子的受精能力,对精子细胞产生的这种有益作用可能与异质二聚体PSP-Ⅰ/PSP-Ⅱ有关,该物质有利于高倍稀释的精子保持活力、运动能力和线粒体的活性。天然PSP-Ⅰ/PSP-Ⅱ对高倍稀释的公猪精子功能所产生的有益作用主要体现在其独立的PSP-Ⅱ亚单位上,并且似乎不需要其多聚糖部分。最佳受精率由受精-排卵间隔、精子受精生命期、母猪个体状况和授精部位的综合影响决定。母猪生殖道中储存的精子越多,占据输卵管的成活精子也就越多,因此只需较少的精液就能够达到采用常规人工授精技术所获得的相同受精率。所以,应该根据精子在母猪生殖道内储存位置的状况开发人工授精技术,而目前考虑的是其它会影响受精成功的因素。深部授精的新方法旨在使精子绕过子宫或限制精子通过子宫而直接进入输卵管,因而可以减少精子因噬菌作用而造成的损失,并可以避免精子的逆流。2工艺教学ai2.1标准1:传统精子输注法目前,人工授精已经很大程度上取代了猪场中的自然交配,究其原因在于人工授精具有经济、简单和快捷(通常由养猪生产者自己操作)的优点,并且已经成功应用多年。对于养猪业来说,其较大的价值体现在全球每年注册的大约有2500万次人工授精上。在欧洲,每年高达85%~90%的猪授精是采用人工授精的。人工授精的目的是在输卵管中建立一个具有适当功能的精子储库,以使所有排出的卵子都能受精。该授精方法借助一根导管吸住子宫颈从而将精液输入子宫颈的后部(大约为子宫颈向里15cm处)。该方法推荐利用一个大容量的导管输入大量的精子(通常超过2500×106个),整个发情期输精2~3次。此方法规定了公猪每次射精可以制成大约20~25份的输精剂量,每头公猪每年平均授精精液产量为1500份,每年大约能给700头母猪授精。虽然当授精的精液所含精子为2500×106个时会出现难以满意的结果,但利用含2000×106个精子的常规人工授精方法,再对猪群进行科学的管理,仍能取得较高的分娩率和窝产仔数。此外,每份精液即使含有1000×106个精子,只要输精时机把握恰当,并且输精过程中精液不出现倒流,也能取得较好的受精率。直到目前为止,常规人工授精足以能满足养猪业的需求。然而,减少可用精子和/或弱化精子细胞(即冷冻-冻融后的精子、性别分流精子、精子基因转移、包被精子,等等)数量的新型精子技术则要求开发新的授精技术,以实现利用较少的精子也能取得满意的受精率。此外,减少获得成功受精所需的精子数量,可降低高附加值精液(即性别分流)的固定生产成本,促进此类新精液生物技术的应用。在过去的数十年里,基于输精剂量输入位点的新授精技术得到了快速的发展,并无疑受到了要求上述新精液技术在养猪业中有效应用的推动。此新方法使精液能够输入子宫内(子宫颈后或子宫内授精)、或深部的子宫角(深部子宫内授精)、或输卵管内(腹腔镜法人工授精)内。2.2精子的输注此授精方法的目的是将精液输入母猪的子宫体内。本世纪初,自1959年Hancock最先报道此授精方法以来,多家实验室和养猪场再次兴起了使用子宫颈后输精的方法,由此表明子宫内输精可减少每次输精所需的精子数和所用的精液剂量。但此方法的主要障碍是母猪子宫颈管,其特征是管内有许多颈褶。已开发的多个输精设备可以使精液穿过经产母猪的子宫颈,把精子直接输送到子宫或子宫后角。大多数这类输精设备与商用人工授精Spirette管配套使用,而后者起到类似子宫锁一样的功能,堵住子宫颈,防止精液倒流。这类输精设备通常比普通导管长15~20cm,通过Spirette管内腔插入,随后穿过子宫颈管向内伸入到子宫内。虽然有关此方法的介绍有很多种,但大多数每次输入30mL含1000×106个精子的精液。此输精方法最主要的优点在于可以减少因精液逆流造成的精子损失,但最近有报道称,逆流精液将占到授精精液的三分之二。Watson报道了英国于2002年首次利用子宫颈后人工授精技术进行的大型商用性试验。结果表明,采用子宫颈后输精技术进行的3000×106、2000×106或1000×106个精子剂量输精,所得到的产仔率和产仔数都与利用常规人工授精技术进行的3000×106或2000×106个精子剂量输精相同,仅在借助常规人工授精技术进行的1000×106个精子剂量输精时,母猪的产仔率和产仔数有所下降(P<0.001)。母猪子宫颈后输精技术具有操作简单、高效和安全的特点,并且每次输入的精子数可以减少到1000×106个。当利用500×106个精子剂量时,也可达到相同的效果。虽然本次试验表明,在进行子宫颈后人工授精时,向子宫直接输入1000×106个精子可以取得良好的受精率,验证了公猪一次性射精可以配制成3份人工授精精液的说法,但是相同的方法却未能在其他猪场取得成功。最近在匈牙利和克罗地亚对1783头经产母猪进行的一次生产现场试验获得了相似的试验结果,采用常规人工授精技术或子宫颈后授精技术的母猪分娩率分别达到88.1%和87.8%,但是采用子宫颈后授精技术的母猪在输入1000×106个精子时,产仔数明显的下降(12.3头∶10.2头)。将子宫颈后授精技术的精子输入量减少到500×106个时,母猪的产仔率[78.0%∶88.2%(常规授精技术产仔率,下同)]和窝产仔数(9.4头∶11.6头)均下降。因此,猪场采取正确的管理措施是非常重要的。子宫颈后人工授精技术的普及率不仅不同国家各不相同,而且即使是同一个国家的不同地区也不相同。在采用本授精方法时应特别注意要采用正确的授精技术,以将对子宫颈及子宫的损伤降至最低程度,因为半刚性的扩展型输精管可能会损伤生殖组织。2.3宫内深部输精法对因子分析的影响子宫内深部输精技术(DeepIntrauterineInsemination,DUI)是将精子输送到较深部位的子宫角的一种方法。笔者所在实验室于1999年首次对本方法进行了介绍,并在贝尔茨维尔举办的“公猪精液保存”大会上作了介绍。影响本技术在母猪中应用的主要障碍是母猪生殖道复杂的解剖学特性,授精效果不仅会受母猪子宫颈部褶皱的影响(与子宫颈后输精法相同),而且还会受子宫角的长度和弯曲特性影响。最初的输精导管是用改良的柔韧纤维内窥镜制成,其长1.35m,外周直径3.3mm,内圈直径1.2mm。两年以后,笔者实验室根据先前所用内窥镜管的推进力和灵活性,利用新的廉价设备制成了新的DUI输精管。这种新的输精管长1.80m,外周直径4mm,内圈直径1.80mm,其操作特点是在插入商用人工授精Spirette管(以便形成子宫锁)后,再在Spirette管内插入DUI输精管,穿过子宫颈管,再向前进入子宫和子宫角。可以预测的是,DUI导管会造成子宫粘膜的潜在性损伤,甚至会危及母猪今后的繁殖力。有报道指出,在当借助柔韧纤维内窥镜进行子宫内深部输精时,可以在一些母猪的子宫内膜壁上留下明显的伤痕。然而,任何已经发生的子宫内膜损伤都不会造成母猪子宫内部或外部的出血。进行子宫内深部输精时和输精完毕之后,母猪子宫的出血率非常低(<2%),并且与常规人工授精法相近。此外,对子宫深部输精实施前(即常规人工授精)和实施后的繁殖性能比较后没有发现显著差异,由此表明子宫内深部输精法不会影响母猪随后的繁殖力。因此,我们推测,输精导管通过子宫颈进入子宫内不会对子宫颈和/或子宫角产生明显的伤害,并且也不会对母猪的繁殖力产生负面影响。然而,输精软导管可以使一侧子宫角产生像子宫内腔输入大量精液后引起子宫扩张一样的相似作用。多项试验证实,将柔韧导管插进母猪一侧子宫角的成功率在90%以上,每次授精大约需3~4min的时间。正如先前讨论到有一次将精液输入了一侧子宫角内。但精子能够到达对侧的输卵管,并能使较高比例的卵母细胞受精。研究表明,精子能从授精子宫角的精液储库运出,并且通过腹膜迁移通道送到另一侧子宫角。这种假设是基于这样一种现象,即虽然借助子宫内深部输精法输入低剂量的精子后能在两侧输卵管内发现胚胎,但仅在一侧输卵管内找到了精子的踪影。我们获得的试验结果充实了此假设:通过腹腔镜将母猪的两侧子宫角切断,随后诱导其发情。结果发现,精子能够经腹膜(trans-peritoneal)和子宫两种不同的途径到达对侧子宫角,并且使大部分卵母细胞受精。虽然经腹膜途径仅使很少部分的母猪(刍5%)怀孕,然而子宫内途径似乎是卵母细胞受精的主要方法(酆75%)。笔者的试验结果表明:与常规人工授精技术相比,子宫内深部授精技术可利用精子密度稀释20倍或原精液至少稀释8~20倍的稀释精液使人工诱变发情的断奶母猪成功怀孕,且不会影响产仔率和窝产仔数。已有多项试验测定了非人工诱变同步发情母猪利用子宫内深部授精技术后的繁殖性能,并对该方法能否适合商业性应用进行了评估。第一个商业性试验在西班牙和美国进行,试验时通过子宫内深部输精技术给母猪输入150×106的稀释精子(20倍稀释),结果采用子宫内深部授精技术的母猪妊娠率与对照组相比并不显著下降,大概降低2.3%~7.0%。在西班牙进行的试验中,试验组母猪的窝产仔数比对照组减少1.2头,差异不明显;而在美国进行的试验中,试验组母猪窝产仔数减少了2.4头,差异显著(P<0.05)。繁殖性能上的这一下降表明了经济效益上的一个潜在损失,并且在总的商业模式中要在实际生产中应用子宫内深部输精法时必须加以考虑的。在实际生产中,利用子宫内深部授精技术进行150×106的稀释精液输精所造成的窝产仔数减少,与存在单侧与局部两侧授精有关。在采用子宫内深部输精技术通过5mL扩充器输入150×106个精子的母猪中,出现局部两侧和单侧受精的母猪比例远高于采用常规人工授精技术输入3000×106个精子的对照组母猪(36%,P<0.05)。同样,在采用子宫内深部输精技术的母猪中,与胚胎的透明带(ZonaePellucidae,ZP)发生反应的精子数少于采用常规人工授精技术的对照组母猪,这说明到达精子储库的精子数很大程度上取决于授精的精子数。在同一天用同一次射精的精液进行授精的每头母猪在胚胎透明带区的副精子数上也存在很大的差异,并且即使是同一头母猪,无论采用哪种授精技术,两个子宫角在胚胎透明带区的副精子数上间也存在着较高的差异。先前有报道称发现了类似的母猪间的差异。母猪固有的特性(即子宫肌层收缩或局部吞噬作用)可能与单侧受精有关。虽然笔者根据自己实验室的初步研究结果,正在研究既能使母猪成功怀孕又能避免出现单侧受精的子宫内深部授精最小输入精子剂量。但是,当利用子宫内深部输精技术给自然排卵的母猪输入含600×106个精子的20mL精液时,既没有观察到卵母细胞的单侧受精现象,也没有见到其局部两侧受精现象。总之,相对于常规人工授精技术而言,采用子宫内深部输精技术可以显著减少每次输精所需的精子数,而与母猪是否为自然排卵或诱导排卵无关。子宫内深部输精技术已使含有150×106~600×106个精子的稀释精液或含1000×106个精子的冷冻-冻融精液获得成功。另外,经流式分选仪分选的精子借助子宫内深部输精技术已可成功地产出仔猪。2.4脏器输精的应用当用高附加值的精子(即性控精子或精子介导转基因精子)进行人工授精时,开发利用超低精子数的小剂量授精技术可以提高授精效率,据认为输卵管内授精能够最大限度地减少每次输精所需的精子数。通过剖腹技术,将冷冻-冻融精子或性控精子直接输入输卵管,已使母猪成功妊娠。遗憾的是,剖腹技术在实际生产中并不实用。与剖腹技术相比,腹腔镜检查技术在将精子直接输入子宫或输卵管时所造成的创伤要小小得多,通过经过技术培训的人员,本技术已能够在养猪场得到应用。已有报道称,腹腔镜检查技术已经被用于使用低精子剂量的绵羊商业性人工输精中。此外,通过腹腔镜技术进行的绵羊人工输精是唯一不会影响受精率的子宫内输精的人工授精方法。就母猪而言,借助腹腔镜检查技术将精子输入子宫角(接近子宫输卵管连接处),可以在每个子宫角仅输入10×106~20×106个精子的情况下实现92.3%的高受精率。但是,当输入的精子剂量减少到5×106时,母猪妊娠率则显著降至81.9%,这些研究结果与先前的报道相一致。在该研究中,研究人员借助剖腹技术将仅含10×106个精子的精液通过外科法授精技术输入母猪子宫内,结果获得了最理想的授精效果。笔者所在的实验室对腹腔镜检查技术进行了改进,以适用于母猪输卵管内输精。这种改进型技术必须麻醉的情况下进行,操作时使母猪呈垂头仰卧姿势,且与水平线呈20°的角度。在母猪腹部接近脐窝处切一个1.5cm长的口子,向上拉起切口边缘以对抗牵引,将一个带有嵌入式0°腹腔镜的12-mmOptoviw套管(EthiconEndo-surgery公司,美国俄亥俄州辛辛那提市)通过伤口插入母猪体内。进入腹腔以后,移走Optiview探头,并用0°腹腔镜取代。在腹腔内注入CO2使压力达到14mm汞柱。将两个辅助端口放在半腹部左右两边,为腹腔镜杜瓦尔(Duval)钳状骨针提供入口。用杜瓦尔钳状骨针分别控制子宫角和夹紧输卵管,使得输精探针顺利进入。在两个输卵管都输入精液后,移去套管针并进行微创缝合。整个小外科手术的进行时间要求控制在15min内。输卵管内输精的确可以将大量的精子(0.3×106~0.6×106)输入管内。母猪卵母细胞中的多精子受精块要少于其他动物,并且在体外时,精子∶卵母细胞比例会影响多精子受精的卵母细胞。输卵管内腹腔镜法授精的使用,预期会出现较高比例的多精子受精卵母细胞。因此,笔者检测了输入精子数(0.3×106、0.5×106和1.0×106)和相对于排卵的输精时机(排卵前、排卵中和排卵后)对受精率的影响。结果表明,当输入的精子数为0.3×106或是0.5×106个时,多精子受精的发生率非常低。因此,利用腹腔镜法授精技术进行极小精子剂量的输精时,使母猪妊娠的可能性较高(图1)。只有当输入的精子数为1.0×106个时,多精子受精发生率才较为明显。输卵管的环境可对直接输入输卵管的精子穿透卵母细胞进行调节。笔者最近对相对于排卵的授精时间(排卵前、排卵中和排卵后)对卵母细胞的穿透和多精子受精发生率的作用进行了评估(图2)。虽然卵巢在输精之前进行了超声波检查,但用腹腔镜观察卵巢的状态是生产现场的一种极好方法(图3)。在进行输卵管内输精时,当输入精液时母猪已经将卵母细胞排入输卵管,此时发生多精子受精的概率会大幅