实验讲义分光光度法测量溶液中色素含量

分光光度法测量溶液中色素含量引言（实验背景）在物质检测分析领域，对样品测试时往往直接采用化学办法，或先采用化学办法预解决后再采用物理办法进行测试分析，这样都要采用化学试剂，对环境造成二次污染。而纯物理办法在整个测量过程没有化学反映，更多依赖于物理手段和数学解决来解决问题，符合环境和谐型社会的发展需求，受到国家的重视和社会各界的欢迎。随着测试办法的转变，人才需求也随之发生转变。以往运用化学分析办法进行物质检测分析，需要大批量化学、生物有关专业人才。而随着物理测试办法的广泛采用，光学、光电专业人才需求越来越大。为了顺应社会需求，适应形势变化，光学、光电专业学生不仅要掌握制造分光光度计的技术，还要创新使用办法，通过实验训练积累知识和经验，方便达成社会人才需求原则，为推动社会的技术进步和发展作奉献。实验目的与内容食品中常添加色素使外观好看而吸引消费者，特别是食品饮料中经常使用人工色素配制成多个颜色。而毒理学证明化学合成色素有不同程度的毒性，有的甚至可致癌。各国相继制订了法规，对食品中合成色素的使用做了限量规定。本实验目的就是要采用光学办法测出溶液中惯用的色素含量。溶液中常使用三种色素显示黄色、橙色或红色：柠檬黄、日落黄和胭脂红，本实验规定：实验前一周进行预习查资料，设计出使用分光光度计同时测出溶液中柠檬黄、日落黄和胭脂红的含量的实验方案，实验方案涉及：1）实验所需条件，涉及仪器设备、材料试剂、工具器材等；2）配制哪些溶液？测量哪些数据？并设计好统计数据的表格以及重要实验环节（注：分光光度计输出的数据量较大，每个样品的测量成果以文献形式保存，请先拟好文献名，填入表格，以免搞错）；3）由实验数据计算柠檬黄、日落黄和胭脂红的含量的办法，并阐明所需使用的软件或拟编写的程序。实验设计方案最少提前一天（需要特殊材料的方案须提前一周）交给任课老师审视，通过审视后方可进行实验。实验时，按照所设计实验方案，配制所需溶液，并使用分光光度计测出对应的光谱数据；数据统计单须交老师审查签字。实验结束后按数据解决规定进行数据解决，一周内上交实验报告，实验报告涉及实验方案、实验原始数据、数据解决结论及误差分析、思考题。实验原理分光光度法是根据物质对不同波长的单色光的吸取程度不同而对物质进行定性和定量分析的办法，常采用吸取光谱曲线来进行分析。所谓吸取光谱曲线，即将不同波长的光依次通过某一固定浓度和厚度的有色溶液，分别测出它们对多个波长光的吸取程度（用吸光度A表达），以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图所画出曲线。由于溶液对不同波长的光的吸取程度是不同，不同溶液的吸取曲线，其形状和最大吸取波长都各不相似，如图1所示，能够作为定性分析的基础。图1不同溶液的光谱吸取曲线1760年，朗伯通过研究后指出：如果溶液的浓度一定，则光对物质的吸取程度与它通过的溶液厚度成正比(1)A为吸光度；I0为入射光强度；I为透射光强度；b为液层厚度；K0为比例常数。 1852年，比耳(Beer)提出光的吸取和光所碰到的吸取物质数量有关；即当单色光通过液层厚度一定的有色溶液时，溶液的吸光度与溶液浓度成正比。(2)A为吸光度；I0为入射光强度；I为透射光强度；C为溶液的浓度；K1为比例常数。 将朗伯(Lambert)定律和比耳(Beer)定律合并，则为朗伯-比耳(Lambert-Beer)定律(3)式中：A为吸光度；T为透射率；b为液层厚度(光程长度)，普通以cm为单位；C为溶液的浓度，普通为物质的摩尔浓度，单位为mol·L-1；ε为摩尔吸光系数，单位L·mol-1·cm-1；（注意：吸光系数有三种表达方式：摩尔吸光系数，单位L·mol-1·cm-1，对应浓度单位为mol/L；吸光系数，单位L·g–1·cm-1，对应浓度单位为g/L；比吸光系数，单位100mL·g–1·cm-1，对应浓度单位为g/100mL。）需要阐明的是，（3）式中的比例系数ε对不同波长的光，其值是不同的，因此吸光度A随波长呈变化的曲线。同一溶液，不同浓度，其吸取曲线的形状相似，最大吸取波长也同样，根据朗伯-比耳定律，其吸光度与溶液浓度成正比，如图2所示，可运用吸取曲线结合吸光度对溶液物质含量进行定量分析。图2同溶液不同浓度光谱吸取曲线 因此，对于单组分溶液，根据最大吸取峰处的吸光度，即可算出溶液中该物质的浓度。具体办法是：先配制已知浓度的溶液，测出吸光度，根据（3）式计算出吸光系数；而后再测待测样品的吸光度，由（3）式计算样品的浓度。 对于多组分溶液，如果各组分之间无互相作用，其吸光度含有加和性，根据朗伯-比耳定律有：(4)如各组分光谱有叠加，则通过解联立方程组能够拟定各组分的浓度。以三组分混合液为例，先用混合液绘制出吸取光谱，再分别用其中的每单一组分绘制出各自的吸取光谱，而后根据所测三条吸取谱线选择三个适宜的波长，在这三个波优点对混合物样品进行测定，其方程式以下：(5)(6)(7)应用行列式克莱姆法则，则可计算获得C1、C2、C3。同一物质，不同的测试波长有不同的摩尔吸取系数，即有不同的敏捷度，由于实际实验有误差，吸光度较小处相对误差较大，而最大吸取波优点的摩尔吸光系数最大，分析测试的敏捷度最高，且最大吸取波优点吸光度绝对误差变化最小，因此三个波长分别选在三种物质的吸取峰处较适宜。当用分光光度计进行测量时，普通会对波长进行扫描，即同时给出许多波长下的测量值，这时为了充足运用现有数据减小误差，可采用最小二乘法对数据进行解决（参考附录3）。普通状况下，采用分光光度法对某种物质进行测量时，物质的吸光系数是未知的，为了获取物质的吸光系数，惯用下列办法：绝对法：选择待测物质的吸取峰波长，通过书刊、手册查阅待测物质在吸取峰波优点吸光系数，运用实验所得的吸光度或透射率或反射率计算获得待测物质浓度。原则对照法：在同样的条件下配制原则溶液及试样溶液，在所选波优点分别测量吸光度，获得原则溶液及试样溶液的A标及A样，通过获得样品浓度。原则曲线法：配制一系列已知含有不同浓度的原则溶液，分别在选定波优点测其吸光度A，然后以原则溶液的浓度C为横坐标，以对应的吸光度A为纵坐标，绘制A-C关系图，获得原则曲线和原则关系方程。在相似条件下测量样品溶液的吸光度，根据原则曲线和原则关系方程即可获得样品溶液浓度。原则加入法：在样品溶液中加入已知含有不同浓度的原则溶液，分别在选定波优点测量其吸光度，根据吸光度变化量和所加已知含有不同浓度的原则溶液浓度变化量的关系，进而获得样品待测物含量。分光光度计是运用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器，它重要由光源、单色器、吸取池、检测器、信息显示系统构成。分光光度计构造构成框图如图3所示。光源光源单色器吸取池检测器信号显示及仪器控制图3分光光度计构造框图光源重要提供符合规定的入射光，较惯用氘灯(165-375nm)和钨灯(320-2500nm)。单色器是将光源发射的复合光分解成持续光谱并可从中选出任一波长单色光的光学系统，重要由狭缝、色散元件（棱镜、光栅）和透镜系统构成。吸取池又叫比色皿，是用于盛放待测溶液和决定透光液层厚度的器件，重要有石英吸取池和玻璃吸取池两种。检测器是运用光电效应将透过吸取池的光信号变成可测的电信号的器件，惯用的有硒光电池、光电管、光电倍增管等。实验仪器和试剂仪器：UV-4501S紫外可见分光光度计，TU1901紫外可见分光光度计（带两个1cm石英比色皿）；基本操作环节见附录1。电子天平；容量瓶、移液管、烧杯等玻璃仪器。试剂：柠檬黄、日落黄、胭脂红（试剂阐明见附录2）；乙酸铵；光学纯水；思考题分光光度计有哪些类型？分别有什么特点？测定过程中产生误差的因素有哪些，并简要进行分析？注意事项：在配制所需浓度溶液过程中，天平读数要精确；玻璃仪器要轻拿轻放，配制完后，清洗干净放回原处。所配制溶液浓度在最大吸取波优点吸光度最佳范畴为0.2~0.8，相称于本实验所用溶液浓度范畴为20~200μg/mL。浓度高低也能够用一定体积（与使用的容量瓶有关，如100mL）中含储藏液多少来表达（如1mL，3mL等），可称“体积浓度”。等数据解决完毕后，再将它转换成原则浓度单位。在一次测量完毕后，比色皿须经光学纯水清洗，待测浓度溶液清洗后，再加入待测溶液进行测试。分光光度计测量经常涉及数十个甚至上千个波长数据，要想运用好这些数据，就可能要解数目巨大的方程组，因此仅靠手工计算是不可能的，需要编程计算或运用软件计算。本实验提供VB编写的计算软件程序或自行采用MATLAB软件或其它软件进行计算。附录1：光谱仪基本操作环节(1)开机，仪器参数设立：打开分光光度计电源开关，预热约20min；在Windows操作系统下启动光谱仪程序，待计算机与光谱仪通讯成功，可进入主工作程序；选择附属功效-狭缝设立设定狭缝宽度。狭缝宽度过大时，入射光的单色光减少，校准曲线偏离比耳定律，敏捷度减少；狭缝宽度过窄时，光强变弱，仪器的增益提高，仪器噪声增大，于测量不利。选择附属功效-波长设立设定波长范畴，波长范畴太大，测试时间太长，并增加数据解决量，增加误差；波长范畴太小，不能完全覆盖物质的吸取光谱宽度，测试数据不全，增加测量误差；因而选择适宜的波长范畴，能够有效减少误差。选择测试-波长扫描进入波长扫描界面-模式选择吸光度或透射率；选择测试-波长扫描进入波长扫描界面-参数设立对扫描次数、扫描速度、起止波长、坐标上下限进行设定；在参考通道与物光通道分别插入装有蒸馏水的石英比色皿，盖好防尘盖，选择附属功效-建立基线进行基线扫描。(2)关机测量工作结束后，退出系统。先关闭系统软件，再关闭分光光度计。取出分光光度计内参考通道和物光通道比色皿分别清洗干净后交老师收存。拷贝好实验数据后，退出Windows操作系统，关闭电源。附录2试剂阐明(1)柠檬黄(酒石黄，Tartrazine)柠檬黄是3-羧基-5-羧基-1-(对磺苯基)-4-(对磺苯基偶氮)邻氮茂的三钠盐，属单偶氮类色素，构造式以下：柠檬黄外观为橙黄色粉末，易溶于水、甘油、丙二醇、微溶于乙醇，不溶于油脂，对热、酸、光及盐均稳定，耐氧性差，遇碱变红色，还原时褪色。最大使用量0.1g/kg，最大吸取波长426nm(2)日落黄(SunsetYellow)日落黄是1-(对磺酸苯基偶氮)-2-萘酚-6-磺酸二钠盐，属单偶氮类色素，构造式以下：其外观为橙红色粉末，易溶于水、甘油、丙二醇，微溶于乙醇，不溶于油脂。最大使用量0.1g/kg，最大吸取波长482nm(3)胭脂红(丽春红4R，Ponceau4R)胭脂红是1-(4’-磺基-1’-萘偶氮)-2-萘酚-6,8-其外观为红色粉末，易溶于水、甘油，微溶于乙醇和乙二醇一乙醚混合溶液。最大使用量0.05g/kg柠檬黄、日落黄和胭脂红的光谱吸取曲线如图4所示图4柠檬黄、日落黄和胭脂红的光谱吸取曲线附录3最小二乘法当在实验中测得自变量x与因变量y的n个对应，，…,时，要找出已知类型的函数关系，使（称为残差）的平方和最小，即：，这种求的办法，称为最小二乘法。 设函数残差为S，则所得的残差线性方程组如（1）式所示：(1)根据数学分析知，欲使残差的平方和S取值最小，要满足的条件是，，…，且其二阶导数不不大于0。经整顿得：(2)对(1)式中各方程求二阶偏导数恒为正，因而(1)式中各方程求得的极值为最小值，满足最小二乘条件，则有：(3)式称为最小二乘法预计的正规方程。将正规方程写成矩阵形式，可表达为：(4)整顿(4)式有(5)