牛胚胎移植技术的应用与发展前景

牛胚胎移植技术的应用与发展前景

胚胎移植技术是胚胎生物工程的基本技术。这意味着将改良后的母亲胚胎移植到其他部位或多个不同条件下的母生殖器的适当部位，以发展和分割后代。事实上，胚胎移植是产生胚胎的过程，是胚胎和繁殖胚胎受体的分离和合作过程。胚胎移植是胚胎工程的重要组成部分,目前已基本成为一项比较成熟的生物技术.1890年英国学者首次在兔上实验成功,20世纪30年代后开始大量研究,1951年在牛上获得成功,1974年第一头胚胎移植的荷斯坦奶牛在美国出生.1976年,一些研究小组报道了采用导管高效采集胚胎的非手术方法,随后胚胎移植在奶牛中的应用得到飞速发展.由于牛经济价值高,产仔数量少,用胚胎移植技术进行纯种扩群繁殖的效果好,且供受体牛均可反复使用,因此牛的胚胎移植技术已较多应用于实际生产中.1理性化的混凝土引物移植技术胚胎移植的基本过程包括:供体和受体的选择、受体的同期发情处理、供体的超数排卵处理和配种、胚胎回收与保存,检胚和胚胎移植.其中超数排卵、胚胎的冷冻保存、胚胎的性别鉴定和分割技术是目前研究的重点和热点.1.1超排和gnrh类似物对混凝土超排效果的影响近年来,许多研究者对简化超排程序作了很多研究,并取得了一定的成果.日本的Yamamoto等(1994)将30mgFSH溶解于10ml30%PVP后,在性周期的第9-13d给经产母牛一次性注射,超排效果比将同剂量的FSH溶解于生理盐水后分次剂量递减注射的效果好.朱化彬(1994)等指出,用30%的聚乙烯吡咯酮溶解后,FSH在牛体内的半衰期为3d,因此可以一次肌肉注射给牛超排,既简化超排程序,又能提高超排效果.在超排处理中运用GnRH及其类似物可以提高超排效果.Foote等(1988)报道,在超排发情以后辅以GnRH类似物处理,优质胚胎数增加.研究表明,用FSH超排后发情当天肌注GnRH采到的发育胚胎总数和受精率均高于注射GnRH组.1.2牛胚胎常用防冻剂牛胚胎常用的冷冻保存方法有以下3种:(1)常规冷冻保存法(或称平衡冷冻保存法):目前,常规冷冻保存法已是一项成熟技术.大多数哺乳动物胚胎保存仍采用传统的平衡冷冻法,其基本方法为:先将牛胚胎放入防冻液中平衡一段时间;装管;以每分钟0.3-0.5℃的速度降温至-7℃,植冰,缓慢降温至-35℃;平衡10min后,投入液氮中保存.在常规冷冻方法中常使用一些防冻剂,牛胚胎最常用的防冻剂是甘油、乙二醇、丙二醇和二甲基亚砜及一些糖类等.Suzuki(1990)、Voelkei等(1992)用丙二醇作防冻剂冷冻牛胚胎均获成功.贾福德(1999)等研究发现,用1.8mol/L乙二醇作防冻剂冷冻奶牛胚胎,其冻后存活率显著高于1.6mol/L丙二醇组.阳年生(1996)的实验结果与此基本一致.(2)直接冷冻法(也称一步细管法).直接冷冻是一种较简便的牛胚胎冷冻方法.它由常规的慢速冷冻法改进而来.目前直接冷冻法大多采用1.5M的乙二醇作为防冻剂.Kasai建立了一种简单的牛胚胎冷冻方法,即在室温下用1.5mol/L甘油+1.0mol/L蔗糖溶液使胚胎预先脱水,后将胚胎装入已装有冷冻液的-30℃预冷细管,再将其置于-30℃下经30min,然后投入液氮.该法省去了细胞外液的诱发结晶或程序降温过程,最终获得了33.3%的妊娠率,稍低于常规冷冻法(妊娠率48.5%).(3)玻璃化冷冻法:1985年,Rall和Fahy首次报道了胚胎的玻璃化冷冻保存方法.将胚胎在玻璃化冷冻液中平衡后,直接投入液氮保存.含高浓度防冻剂的溶液在快速降温过程中,即由液态转变为玻璃化状态.这一方法不需要进行缓慢的降温过程,大大简化了胚胎冷冻程序,且不需要昂贵的胚胎冷冻仪,1.3sry—胚胎的性别鉴定目前最常规的鉴定胚胎性别方法是PCR鉴定法,可利用雄性特异性基因探针和PCR扩增技术鉴定胚胎性别.随着哺乳动物的性别决定基因SRY的发现,其与PCR技术相结合被称为SRY-PCR法.据Bredbacka等(1995)报道,他们已将SRY—PCR鉴定技术加以改进,主要是在制备PCR引物时,就将其结合在一条多重复的(60000倍)牛Y染色体特异DNA序列的多个位点上.当牛Y染色体特异DNA序列存在时,引物和核苷酸的浓度以及其他PCR的条件就可足以使PCR扩增为大量的DNA.检测分析时只要在UV光下直接观察含有溴化乙锭的PCR反应混合物的颜色便可知晓.如试管中含有Y染色体特异DNA序列,其扩增DNA的量则多,呈粉红色,即为雄性胚胎;如Y染色体特异DNA序列,其扩增DNA的量则少,则无色,即为雌性胚胎.1.4半胚的引生或解冻冻前半胚的培养是胚胎分割技术的关键,分割胚冷冻后妊娠率显著低于未分割胚,主要因为切割部10%-15%左右的细胞因显微手术而损伤,胚细胞形成切割面;细胞数减半,透明带损伤.T.Suzuki(1988)认为,胚胎分割后培养2-3h,可使切割面修复,促进半胚细胞增殖;使分割过程中由于分割工具机械力作用沿分割轴线发生非生理性位移的细胞恢复到正常生理位置,移植效果较好.将分割后的半胚用20%FCS—PBS培养液洗净后分3段(中间段含胚胎)成对装入0.5ml塑料细管不封口,置于CO2培养箱(37℃、饱和湿度)培养1-3h使其发育复原.另据Picard等(1984)报道,不同培养液对解冻后半胚的存活率影响不大,随培养时间的延长,冷冻半胚解冻后的可用率降低.分割胚的冷冻方法目前通常采用一步细管(Openstepstraw)冷冻法.将分割胚胎依次用3%、6%、10%(V/V)的甘油备平衡10min后用琼脂包埋法进行包埋,再把胚胎放到灭活(inactivation)的血清中,然后移到1%(V/V)的琼脂溶液中;在37℃的环境中用0.3mm内径的吸管把胚胎同琼脂一起吸取,在室内稳定,把不要的琼脂除去;然后用1.0mm内径的吸管将胚胎吸上,等琼脂稳定后移到1.2%的琼脂中,再用1.0mm内径的吸管把胚胎吸上,然后装入0.25ml塑料细管供冷冻保存或移植.2其他相关技术2.1冻胚移植后回采后回血回复突变.诱导双犊是提高牛繁殖率的重要技术.英国的Powson等人给仅存一个黄体的子宫角放入一个受精卵,双胎率达到73%.河北省胚胎移植研究中心的桑润滋等人把7日龄的冻胚移植到双侧子宫角受胎率为61.5%,双胎率为50%,移植到一侧子宫角受胎率为52.2%,双胎率为41.7%.2.2go期与go-go期Wakayama报道了一种新的体细胞克隆方法.具体方法是(以小鼠为研究对象)或以雄鼠的睾丸支持细胞,或以神经细胞(来自大鼠大脑皮层),或以卵丘细胞作为核供体.这是因为支持细胞和神经细胞都处于Go期,包围在卵泡周围的90%以上卵丘细胞也都处于Go期.Shiga等、Vignon也将处于不同细胞周期的供体细胞不经体外培养,立即进行核移植,核移植的卵细胞质,经激活后,重组胚胎经体外培养后,移植给受体.2.3克隆牛5个核细胞的培养高等动物的体细胞是高度分化的,而去核卵细胞的细胞质里含去分化因子,能够使移入的体细胞核去分化和重新程序化,关闭的基因被重新打开,成为具有胚胎细胞特性的全能性细胞,能够继续发育分化,形成囊胚后再移殖到受体牛的子宫里生产克隆牛.体细胞克隆的过程包括细胞系的建立、Go期的诱导、卵母细胞收集和取核、细胞融合与激活和重组胚的培养.1998年,Cibelli和Vignon分别采用34日龄和50~60日龄胎儿成纤维细胞为供核细胞,成功产下了克隆牛.Zakhartchento等用2~3岁牛乳腺细胞为供核细胞,体外培养1~5代,核移植后共获93枚融合胚,其中32枚(34%)发育到囊胚.Kato等采得宰杀牛输卵管上皮细胞为供核细胞,经培养传代和血清饥饿处理,核移植后共获94枚融合胚,其中24枚(23%)发育到囊胚,把4枚移植给2头受体,成功产下了3头牛犊(其中1头出生后死亡).Vignon等采取50~60日龄牛胎儿肌肉细胞为供核细胞,培养3~12代,核移植后,最终获25%的妊娠率.K.Shiga等采取2岁的公牛肌肉细胞为供核细胞,培养至少4代,经血清饥饿或不经血清饥饿培养,核移植后,移植给受体,成功产下了牛犊.Zakhartcherko等采取1头2-3岁牛的耳部成纤维细胞,培养1~5代后作为核供体,核移植后成功产下牛犊.3牛胚胎的选择和质量控制3.1鲜胚移植与冻胚移植目前市场上的牛胚胎来源广泛,从生产胚胎采用的技术上可分为体内胚胎和体外胚胎;从胚胎的保存形式上可分为新鲜胚胎和冷冻胚胎.当前牛体外生产的胚胎已可达到40%的受胎率,这项技术是扩大胚胎来源和降低成本的有效途径,尤其是结合活体采卵技术,可极大地提高供体母牛的胚胎生产效率.采用鲜胚移植与冻胚移植各有利弊(见表1),为了保证移植的受胎效果,有条件的最好采用鲜胚移植法.3.2抗寒性细胞发育在显微镜下对胚胎进行质量鉴定,根据胚胎的形态、分裂球的大小、均匀度、透明带的间隙和变形情况,将胚胎分为四级:—级胚:胚胎形态完整,轮廓清晰,呈球形,分裂球大小均匀,结构紧凑,色调和透明度适中,无附着的细胞和液胞.二级胚:轮廓清晰,色调和细胞密度良好,可见到少量附着的细胞和液胞,变性细胞约占10%-30%.三级胚:轮廓不清晰,色调发暗,结构较松散,游离的细胞和液胞较多,变性细胞约占30%-50%.四级胚:轮廓模糊,色调暗,结构松散,碎片细胞和液胞很多,变性细胞约占50%-80%.一般而言,一、二级胚胎适于移植,三级胚胎移植成功率很低,四级胚胎不宜移植.一、二级胚胎可作冷冻,三、四级胚胎不能作冷冻.级别较高的胚胎受胎率较高,一、二、三级的胚胎受胎率分别为51.5%、51.0%和35.0%,呈依次下降趋势.4胎盘移植的重要性4.1胚数与所需培养的平衡通过对母牛的超排处理,优良供体一次获多枚胚胎,并可重复处理.小西等对41头日本和牛重复处理4次,头均可用胚数均在5.6枚以上.就整体水平而言,由一头供体通过超排回收的胚胎,经移植获得2~9头犊牛.而采用传统的自然交配和人工授精技术,一头优秀母牛一生最多只能生产10头左右的犊牛.因此,应用胚胎移植技术比自然情况下能增殖若干倍,从而可极大地增加优秀个体的后代数,充分发挥优秀母牛的遗传和繁殖潜力.4.2含mda动物优良性状的基因库应用胚胎的冷冻技术可使优良品种牛或特殊品种牛和野生动物胚胎长期保存,以保护良种资源,需要时可随时解冻移植,它与冷冻精液、冷冻卵母细胞共同构成动物优良性状的基因库.许多国家通过建立动物胚胎库的方式保存良种资源,以防止某一地区的优良品种因受各种因素的影响而发生绝种.4.3做好胚胎的制作日前世界上许多国家和地区疫情发生比较严重,在进行繁殖和直接进口活畜过程中,通过接触等途径有可能传播传染病,从而加大引进活畜的风险.有试验结果表明,牛的白血病病毒、口蹄疫病毒等不会通过胚胎传染给受体牛或新生犊牛.同时由于胚胎的透明带具有阻止细菌、病毒入侵的作用,只要做好以下几点工作,可防止疾病传播.①做好卵母细胞体外受精的质量监控,严防精液受污染和阻止病原微生物进入胚胎生产过程;②严格把握供体牛处理、胚胎收集过程的标准化程度,保护胚胎透明带的完整性和保证胚胎洗净,生产“无病原胚胎”(pathogenfreeembryos);③确保生物制品来源可靠、无污染,胚胎移植操作符合卫生标准.因此,引进、生产和移植胚胎具有相对的安全性.5不同排污率目前胚胎移植仍存在一些问题.如纯种动物胚胎来源主