性控冻精技术的影响因素

性控冻精技术的影响因素

性别控制是指动物出生之前控制其性别，改变后代的自然性别比例，并根据人类意愿开展特定性别的家禽生产。这对优质高效畜牧业具有重要意义。首先,可使受性别限制或影响的生产性状(如泌乳性状)能获得更大的经济效益。其次,可增强良种选育中的选择强度,获得最大的遗传进展。第三,可以排除畜群中有害基因或不理想的基因,避免出生伴性遗传疾病后代。分离X、Y精子并分别用于人工授精是控制家畜性别最简单可行的方法。目前,用流式细胞仪改造而成的精子分离仪分离动物X、Y精子已经成功,并用于奶牛生产实践。然而,由于精子分离仪分离精子的速度有限(每小时大约分离10×106个X或Y精子),因此,用通常的输精剂量进行性控精液人工授精(AI)几乎是不现实的,必须采用低剂量的性控精液输精。尽管近年来经过努力研究,低剂量性控精液输精效果已有明显改进,但受胎率比常规人工授精还是略低一些。因此,性控精液人工授精的技术环节还有改进和优化的空间。根据常规人工授精的经验,许多因素,如受配牛群管理、精液处理过程以及输精员操作水平等,都会影响性控精液人工授精的成功率。为优化性控精液人工授精技术,提高其效率,我们以常规冻精和稀释常规冻精为对照,研究了解冻方法、输精时间和部位、不同精液来源和输精员以及育成和经产牛等因素对性控冻精人工授精妊娠率的影响。研究结果说明,精确控制人工授精各个技术环节可以实现消除性控与非性控、低密度与高密度精液之间的差别,获得高妊娠率。1不同规格冻精的单因素试验1.1受配奶牛2005-2008年分别在济南佳宝第一牧场、莱芜杰瑞牧业科技开发中心、临沂畜牧示范园、临沂奶牛合作社和临沂盛能奶牛胚胎公司等5个试验基地进行奶牛性控冻精的应用研究。试验中受配奶牛除特别说明外均为大于16月龄、体况良好和发情周期正常的育成牛。1.2精液性控冻精为流式细胞分离仪分离后冷冻保存的X精子,分别来源于黑龙江省大庆市田丰生物工程有限公司和加拿大IND爱德公司。性控冻精的规格为0.25mL/支,每支含2×106个精子,活力≥0.3,X精子含量≥90%。试验中应用的常规冻精来源于北京奶牛中心,规格为0.25mL/支、每支含10×106个精子,活力≥0.30。稀释常规冻精为常规冻精解冻后用PBS稀释,再装入细管,规格为0.25mL/支、每支2×106个精子。1.3精液解冻从液氮罐中取出冻精细管,立即根据试验设计要求置于不同温度水浴不同时间解冻。自水浴取出后的细管,擦干后剪去一端。取1滴精液滴于载玻片上,盖上盖玻片镜检,活力≥0.3的装入输精枪中,准备授精。1.4输精5个试验牛场各选出1名技术熟练、经验丰富的人工授精员,进行严格技术培训后实施人工授精操作。各试验牛场在试验期间特别加强对受配奶牛的发情观察,只有静立接受爬跨的奶牛才判断为发情。输精前对发情奶牛进行直肠检查,有排卵前大卵泡者进行人工授精。根据试验安排,授精的部位分别为子宫体、子宫角基部或子宫角前端。除非特别说明,输精剂量均为1支细管/头牛。1.5妊娠诊断输精后60~90d,对奶牛进行直肠检查,确定妊娠率。1.6数据分析试验至少重复3次。数据用SPSS11.5(Chicago,IL,USA)统计软件的ANOVA模块进行单因素方差分析。在进行ANOVA分析之前,百分数要进行反正弦转换。数据均以x—±sx—±s表示,P<0.05认为差异显著。2结果2.1不同冻精对牛奶性控冻精人工授精的影响首先观察了解冻水浴时间对奶牛性控冻精人工授精妊娠率的影响。于发情牛静立接受爬跨后12~14h,将性控冻精、常规冻精或稀释常规冻精从液氮罐中取出,置于39℃水中水浴10、20或30s解冻。解冻精液授精于有排卵前卵泡侧的子宫角基部。结果显示,3种冻精中,水浴10s和20s的妊娠率差异不显著,但水浴30s妊娠率显著下降;3种冻精相同解冻水浴时间的受胎率差异不显著(表1)。然后,我们观察了解冻水浴温度对奶牛性控冻精人工授精妊娠率的影响。将3种冻精分别于37、38、39和40℃下水浴10s解冻。输精方法同上。结果显示,常规冻精和稀释常规冻精38~40℃解冻妊娠率差异不显著,但37℃解冻妊娠率显著降低(表2)。性控冻精37℃和38℃解冻妊娠率显著低于39℃和40℃。2.2不同给精时间对妊娠率影响冻精于39℃水浴10s解冻。受配牛静立接受爬跨后不同时间进行子宫角基部输精。结果显示,常规冻精10~11h和12~14h输精受胎率差异不显著,但16~18h输精妊娠率显著下降。而性控精液和稀释常规精液则只有12~14h输精的受胎率很高,其他2个时间点妊娠率都显著下降(表3)。说明低密度精子输精对输精时间要求更严格。2.3不同部位输精妊娠率比较冻精于39℃水浴10s解冻。受配牛静立接受爬跨后12~14h分别输精于子宫体、子宫角基部及子宫角前端等部位。结果显示,3种精液都是输精于子宫角基部妊娠率显著高于子宫体和子宫角前端,而后2个部位输精妊娠率差异不显著(表4)。说明子宫角基部输精效果最好。2.4水浴中控冻牛来源于黑龙江省大庆市田丰生物工程有限公司和加拿大IND爱德公司的性控冻精于39℃水浴10s解冻。受配牛静立接受爬跨后12~14h子宫角基部输精。对46头用大庆精液输精和50头用加拿大精液输精的育成母牛受胎率分析结果显示,2种性控冻精妊娠率没有显著差异(表5)。2.5输精员获得受胎率对5个输精员分别在各自实验牛场采用相同方法和条件进行性控冻精输精的结果进行了统计分析。性控冻精39℃水浴10s解冻。发情牛静立接受爬跨后12~14h输精于子宫角基部。结果显示,5个输精员获得的受胎率都在80%以上,且没有显著差异(表6)。说明只要控制好解冻和输精方法等条件,技术熟练的输精员都能获得好的结果。2.6患者3g,lhph-3冻精于39℃水浴10s解冻。奶牛静立接受爬跨后12~14h输精于子宫角基部,同时注射促排3号(LHRH-A3,宁波市激素制品有限公司)50μg。结果显示,3种精液促排卵素3号处理后都提高了妊娠率,且性控冻精和常规冻精处理组和对照组差异显著(表7)。2.7牛静立接受的不同冻精于39℃水浴10s解冻。受配牛静立接受爬跨后12~14h子宫角基部输精。结果显示,3种精液都是育成牛妊娠率大大高于经产牛(表8)。3输精对妊娠率的影响常规冻精的人工授精实践证明,冷冻精液的解冻速率对精子的活力有显著影响,而采取什么解冻速率往往受冻精时采用的冷冻保护剂、甘油浓度、包装方法及冷冻速率等因素决定。据DeJarnette等报道,不考虑稀释剂类型和降温速率,细管冷冻牛精液通常采用33~35℃水浴30~40s解冻。国内常规细管冻精通常是在35~39℃水浴中孵育5~20s解冻。对于性控冻精,一般也沿用这种解冻方法。然而,许多研究证明,细管冻精快速解冻(55℃,8s)的精子活力和其他指标明显好于慢速解冻(5℃,3min)。我们的研究结果也证明,对于常规冻精和稀释常规冻精,38、39或40℃,10s解冻效果要好于37℃,10s,而对于性控冻精39℃或40℃,10s要好于38℃和37℃,10s。说明性控冻精对解冻速度要求更严格,速度应该更快些。我们还发现,在39℃水浴中停留过长时间(30s)对精子不利。试验结果显示,常规冻精10~11h和12~14h输精受胎率差异不显著,但16~18h输精妊娠率显著下降。而性控精液和稀释常规精液则只有12~14h输精的受胎率很高,其他2个时间点妊娠率都显著下降。有研究表明,牛常规人工授精获得最高受胎率的输精时间是在发情开始后6~18h。这说明,低密度精子人工授精对输精时间要求更严格。另外,本研究证明,促排卵素3号处理提高了3种精液输精的妊娠率。大家知道,牛的LH高峰一般出现在发情开始后12~15h,排卵一般在LH高峰后24h发生。因此,我们于母牛发情后12~14h注射促排卵素3号正好促进了体内LH高峰的出现,使排卵前卵泡及时排卵受精。本研究中,3种精液都是输精于排卵卵泡同侧子宫角基部妊娠率显著高于输精于子宫体和子宫角前端。输精于子宫体的精液无疑会降低有效精子密度,因为有一部分精子可能要迁移到非排卵侧输卵管。McKenna等分析大规模常规冻精输精结果以及Seidel等统计大规模性控冻精输精结果都发现,双侧子宫角输精和子宫体输精受胎率差异不显著。至于子宫角前端效果不如子宫角基部的原因,我们认为可能是由于输精到这个部位操作容易造成子宫内膜损伤的缘故。与本研究结果类似,Kurykin等用性控冻精对用前列腺素发情同步的育成牛进行子宫角不同部位输精发现,子宫体、子宫角中部和宫管结合部的受胎率分别为41.8%、49.1%和39.3%。本试验中用3种精液分别对育成母牛和经产母牛进行子宫角基部输精结果显示,经产牛的受胎率只有50%多,而育成牛的受胎率则高达80%以上。据报道,在饲养管理条件(营养、疾病控制、发情鉴定,精液处理及输精技术)十分优化的情况下,育成牛的受胎率一般都高于泌乳母牛。试验反复证明,在管理条件好时,育成牛用低密度性控精液输精的妊娠率与用常规精液输精几乎相当。然而,如果管理较差,性控精液的受胎率则往往很低;经发情同步处理、按约定时间输精,而不是见到允许爬跨再输精时,育成牛的受胎率也很低。然而,如果通过超声波检查和查记录等方法选择生殖机能完全正常的经产奶牛进行性控精液输精,妊娠率则可能达到育成牛的水平。总之,我们以常规冻精和稀释常规冻精为对照,研究了解冻方法、输精时间和部位、不同精液来源和输精员以及育成和经产牛等因素对性控冻精人工授精妊娠率的影响。结果显示,精液解冻水浴温度和持续时间对人工授精效果有显著影响,性控精液对解冻水浴温度更敏感;性控冻精和稀释常规冻精比常规冻精对输精时间要求更严格;3种精液输精到排卵卵泡同侧子宫角基