睾酮对牛眼小梁细胞mdna和蛋白表达的影响

睾酮对牛眼小梁细胞mdna和蛋白表达的影响

根据流行病学研究，核电站青年：女性为1.00:1.01，其中核电站闭角形青年：女性为1.00:1.53，核电站开角形青年（poag）：女性为2.55:1.00。这种差异的存在提示POAG发病与性激素可能存在一定的关系。Agapova等发现雄激素可能与青光眼发病有重要联系。眼是性激素作用的靶器官,睾酮在POAG的发病过程中是否起到一定的作用,是本次研究的重点之一。已有研究证明组织型谷氨酰胺转移酶(tissuetransglutaminase,tTG)与POAG发病密切相关。那么,雄激素的存在,是否可以通过上调tTG在小梁细胞中的表达,从而在POAG的发展过程中起作用,是本次实验的研究重点。1材料和方法1.1试剂和仪器新生牛眼球来自武汉市牛羊加工厂,2h内用冰瓶运回实验室进行细胞培养。胎牛血清(Hyclone公司),DMEM+F12培养基(Gibco公司),鼠抗人Ⅳ型胶原蛋白、鼠抗人纤维连接蛋白、鼠抗人层粘连蛋白(Gibco公司),鼠抗人tTG(美国Labvision公司),SP二抗试剂盒(福州迈新公司),睾酮注射液(天津金耀氨基酸有限公司),Trizol试剂(Sigma公司),逆转录试剂盒(TOYOBO公司),引物由上海生工生物技术有限公司合成。1.2方法1.2.1小梁细胞的dmem培养在超净台内剪去眼周围的筋膜组织后,将其浸泡于0.2×10-6g·L-1氧氰化汞+4000U·mL-1庆大霉素的水溶液中30min。D-Hanks液冲洗眼球3次后,显微镜下分离取出小梁组织切成1mm×2mm的碎块,均匀地贴于培养瓶的瓶底。将培养瓶在37℃、体积分数5%CO2恒温箱内倒置3h后,待组织块贴壁微干后,加入体积分数20%胎牛血清DMEM培养液适量。将培养瓶放入37℃、体积分数5%CO2恒温箱内进行培养。小梁细胞游离出组织块后,每周换液2次。等细胞长满培养瓶瓶底时,即达到汇合后,用2.5g·L-1胰蛋白酶消化后按1:2的比例进行传代培养。制作细胞爬片并行Wright染色及免疫组织化学鉴定。1.2.2血清anps教育将细胞分为5组。将睾酮用无水乙醇溶解后配成浓缩液,将这5组细胞的培养液吸净并用D-hanks洗2次,加入不含血清的培养液,再分别加入18×10-3mmol·L-1、36×10-3mmol·L-1、54×10-3mmol·L-1、72×10-3mmol·L-1的睾酮,放入37℃、体积分数5%CO2恒温箱内培养24h;正常对照组不加睾酮。1.2.3引物合成及pcr扩增取第3代近融合的牛眼小梁细胞(bovinetrabecularmeshworkcells,BTMC)(每培养瓶大约1×106个细胞)采用Trizol试剂盒(美国MRC公司产品)提取总RNA后。采用TOYOBO公司生产的逆转录试剂盒完成逆转录反应。利用Primer5.0软件设计牛tTG特异性引物并合成(上海生工生物技术有限公司合成)。tTG引物序列:上游:5’-GTTCCAGTTCGTGCCATCA-3’,下游:5’-CCCTGTCTCCTCCTTCTCG-3’,扩增后片段长度为433bp。内参扩增引物序列:上游:5’-GTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3’,下游:5’-GACTGCTGTCACCTTCAOCGT-3’,扩增片断长度为212bp。取cDNA进行PCR扩增,PCR循环参数:94℃变性1min,52.4℃退火40s,72℃引物延伸1min,循环40次。取9μLRT-PCR产物与1μL上样缓冲液充分混合后,点样于20g·L-1琼脂糖凝胶中电泳20～30min,紫外透射仪上观察并照相。用凝胶图像分析仪摄片,以内参照作为标准,对各泳道进行相对积分值的测定,半定量法比较各实验组tTGmRNA相对含量。1.2.4蛋白免疫的测定收集各组培养细胞,溶于RIPA裂解液中,Ep管冰上操作,反复吹打后,置4℃冰箱10min,取出于4℃12000r·min-1离心30min,吸出上清液,总蛋白浓度的测定采用Bradford方法测定,BSA作为标准蛋白,设定标准蛋白浓度梯度。取等量蛋白40μg,经SDS凝胶电泳、转膜、封闭液封闭,按照说明书比例用封闭液稀释一抗和二抗,在孵育袋中孵育一抗4℃过夜,取出用TBST洗膜3次,每次5min,再在孵育袋中孵育二抗,37℃1.5h。ECL发光法显色:将ECL化学发光试剂盒中A、B两种液体按照1:1混合,淋于NC膜上,在暗室内可见蛋白质条带发出绿色荧光,曝光于Kodak底片上,洗片。扫描结果以美国KodakdslD系统进行半定量分析。1.3统计分析使用SPSS13.0统计学软件进行t检验,分析组间表达差异性,α=0.05。2结果2.1相对积分光密度值以β-actin为内参照,计算各泳道相对积分光密度值。当睾酮浓度为18×10-3mmol·L-1、36×10-3mmol·L-1、54×10-3mmol·L-1、72×10-3mmol·L-1时,其相对积分光密度值分别为1.461±0.021、2.111±0.016、2.536±0.032、3.176±0.026,正常对照组为1.487±0.013(图1)。各组间tTG表达水平存在差异,随着睾酮浓度的增加tTG表达水平也相应增加,BTMC内tTGmRNA水平呈睾酮浓度依赖性。2.2不同酮浓度小梁细胞ttg蛋白的表达所测结果显示,在未受睾酮刺激的小梁细胞中,tTG蛋白几乎不表达,或处于一种失活状态,而当睾酮浓度达到72×10-3mmol·L-1时,小梁细胞tTG蛋白的表达明显增加(图2)。RT-PCR与Westernblotting的结果显示,tTG在正常情况下存在于小梁细胞内,但是表达甚少,通过雄激素睾酮刺激后,tTG不仅在基因水平表达增加,而且蛋白水平表达也有增强。3群体诱导物激活剂t-pcr本实验用不同浓度的睾酮刺激BTMC,发现随着雄激素睾酮浓度的增加,BTMC中tTG的表达也随之增加。说明雄激素睾酮对tTG表达的作用有浓度依赖性。Tovar-Vidales等报道青光眼患者小梁细胞中tTG的表达明显高于正常人群。tTG释放到细胞外基质(ECM)中,并发挥其蛋白交联作用,使ECM蛋白交联并抵抗降解,其作用底物有纤维连结蛋白、层粘连蛋白、Ⅲ型胶原、vitronectin等,因而造成ECM堆积。由于tTG的增加使得ECM发生堆积,最早人们将这些沉积物描述为“斑块样物质”(SD斑),随着SD斑形成增多,最终导致小梁网和Schlemm管发生狭窄甚至堵塞,使房水外流阻力增加,眼压增高。另外,金属蛋白酶(MMP)是一类锌离子依赖性内源性蛋白水解酶,主要功能是降解ECM和基底膜,而tTG可优先结合MMP-2的激活物,使MMP-2生成下降。MMP的减少使得ECM降解减少,也有可能导致房水外流阻力的增加。郝风芹等用RT-PCR的方法检测BTMC中性激素受体蛋白mRNA的表达,结果显示BTMC有性激素受体表达。根据本实验我们可以推断睾酮可能上调tTG的表达活性,一方面睾酮可能通过激素受体作用,使得tTG合成增加,另一方面睾酮可能与细胞膜表面的雄激素受体结合,开放Ca2+通道,使得细胞内Ca2+浓度增加,更多的Ca2+与tTG结合而使这种酶激活发挥作用。睾酮使tTG合成增加,t