复合酶辅助法提取人参总皂苷工艺研究

复合酶辅助法提取人参总皂苷工艺研究

人参属5个加科，主要用于身体和心灵疾病的治疗。人参中含皂苷类、糖类、蛋白质、挥发性成分、黄酮类、维生素、酶类、木质素以及微量元素等成分,其有效成分之一为人参总皂苷,具有抗肿瘤、调节血糖、抗衰老、溶血及抗溶血、镇痛、抗补体等作用,对人体神经系统、心血管系统、内分泌系统、免疫系统等具有广泛的生物活性,并已经广泛应用于临床实践。人参总皂苷的提取方法较多,如浸渍法、回流法、超声波法、超临界萃取法和微波法等,但是提取率一般不高。考虑到植物的有效成分大多被细胞壁包裹,而细胞壁的成分主要为纤维素、半纤维素、果胶质、结构蛋白等,利用复合酶处理,可改变植物细胞壁的通透性,有利于更有效地提取有效成分。本研究尝试运用复合酶辅助提取法,提高人参总皂苷提取率,提高人参资源的利用率。1材料和方法1.1人参皂苷re人参:为平地栽参地下部分制成的生晒参,由吉林农业大学张连学教授鉴定为4年生全须生晒参。茎叶:为6年生平地栽参地上部分,粉碎,过60目筛,备用。人参皂苷Re,中国食品药品检定研究院;中温淀粉酶、中性蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、甘露聚糖酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶,苏州昆蓝生物科技有限公司;香草醛、无水乙醇、浓硫酸等均为分析纯。1.2紫外分光光度计百灵LA114型电子天平,常熟市百灵天平仪器有限公司;UV-754紫外可见分光光度计,山东高密彩虹分析仪器有限公司;LD5-2A型低速离心机,北京医用离心机厂;SHA-C数显水浴恒温振荡器,金坛市江南仪器厂;HH-W-600型数显恒温水箱,金坛市江南仪器厂。1.3最佳提取工艺的确定考虑到不同生物酶的作用对象不同,在实验过程中,首先通过单因素实验,优选出若干种对人参总皂苷提取作用明显的生物酶及其作用条件,然后通过正交试验考察各因素之间(包括所选的各种生物酶之间及其反应时间、反应温度)的复合作用,最终确定人参总皂苷的最佳提取工艺。1.3.1不同酶最佳提取条件的确定选用中温淀粉酶、中性蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、甘露聚糖酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶9种酶,在酶各自的适宜条件下对人参根及茎叶总皂苷进行提取,分别考虑各单酶的最佳提取条件。1.3.2复合酶法提取人参根及茎叶总皂苷的正交试验以单因素酶解试验为基础,对人参根进行正交试验L9(3)4,对人参茎叶进行正交试验L18(3)5,确定复合酶法提取人参根及茎叶总皂苷的最佳条件,优化提取工艺。1.3.3统计方法2结果与讨论2.1香草醛-乙醇溶液的制备精密量取人身皂苷Re对照品溶液20、40、60、80、120、160、200μl,分别置于10ml具塞试管中,以相应试剂为空白。放置于60℃恒温水浴锅中挥干后,放置于冰水中;分别加16%香草醛-乙醇溶液0.5ml和77%浓硫酸5ml,摇匀,置于60℃水浴锅中反应10min后,再冰水浴15min;紫外可见分光光度计于544nm测定吸光度,以皂苷含量为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,得到回归方程:y=0.00411x-0.0718,r2=0.9990。2.2单因素实验2.2.1不同酶提取处理对人参皂苷得率影响取9份干燥人参根粉末各0.5g,精密称定,置于100ml三角瓶中,分别加入中温淀粉酶等9种单酶。加酶量为人参粉末质量的5‰,加入50ml水。分别于25℃、40℃、60℃恒温振荡水浴3h,再于100℃水浴提取2h。分别测定不同种类的酶在不同温度下的人参根总皂苷提取率,结果见表1。从表1中可以看出,提取温度对人参皂总苷的提取率有影响。在60℃条件下总皂苷得率最高,25℃次之;且在这两种温度下,加酶组总皂苷得率普遍高于空白对照。40℃皂苷得率最低。效果最好的酶是中温淀粉酶、中性蛋白酶。2.2.2反应温度对总皂苷提取率的影响以中温淀粉酶和中性蛋白酶处理人参根。分别测定加酶量为底物含量的0、1‰、5‰、1%、5%,反应温度为60℃时总皂苷的提取率。结果见表2。由表2可知,中温淀粉酶的加酶量为1%时,皂苷的提取率最高。中性蛋白酶的加酶量为5%时,皂苷的提取率最高。2.2.3聚糖酶的提取取人参茎叶粉末0.5g,精密称定,置于100ml三角瓶中,分别加入药材量5‰的中温淀粉酶、中性蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、甘露聚糖酶。加入50ml蒸馏水,60℃恒温水浴振荡3h,再置于100℃恒温水浴锅中提取2h。分别测定不同种类的酶对人参茎叶总皂苷提取率的影响。结果见表3。由表3可知,在温度为60℃时,人参茎叶在纤维素酶、漆酶及甘露聚糖酶的作用下有较高的总皂苷提取率。而在其他酶作用下,茎叶皂苷总提取率低于或接近无酶条件。2.2.4加酶量为底物含量的总皂苷的提取率以纤维素酶、漆酶、甘露聚糖酶处理人参茎叶,分别测定反应温度为60℃时,加酶量为底物含量的0、1‰、5‰、1%、5%时总皂苷的提取率。结果见表4。由表4可知,三种酶均在5%加酶量时皂苷提取率最高,且每种酶的1%和5%加酶量的皂苷提取率均比较接近。2.3正交试验设计2.3.1复合酶法提取人参根总皂苷的最优条件根据单因素试验的结果,以中温淀粉酶(%)、中性蛋白酶(%)、时间(h)、温度(℃)为因素,设计L9(3)4正交试验。因素水平、直观分析及方差分析如表5、表6及表7所示。由表6可以看出,各个因素对人参根总皂苷的提取率的影响程度依次为:中温淀粉酶>中性蛋白酶>时间>温度。复合酶法提取人参根总皂苷的最佳条件为:A3B2C1D3。表7显示,A、B、C、D四个因素中并无显著因素。即4个因素对人参根总皂苷的提取率作用都不明显,但各因素比较,因素A和B明显高出因素C和D。所以在使用酶法提取人参根皂苷时,应注重酶用量。结合直观分析、方差分析、酶的特性以及从能量消耗和节约时间等方面考虑,确定最佳提取工艺为A3B2C1D3,即:中温淀粉酶用量5%,中性蛋白酶用量1%,反应时间2h,反应温度60℃。在此条件下进行验证试验,人参根总皂苷提取率分别为5.55%、5.52%、5.43%,其平均提取率为5.50%。2.3.2正交实验结果根据单因素的实验结果,以漆酶(%)、纤维素酶(%)、甘露聚糖酶(%)、时间(h)、温度(℃)为因素设计L18(3)5正交试验,其因素水平、直观分析及方差分析如表8、表9及表10所示。由表9可知,在A、B、C、D、E等5个因素中,对人参茎叶总皂苷提取率影响程度大小依次为:漆酶>纤维素酶>甘露聚糖酶>时间>温度。其复合酶法提取人参茎叶总皂苷的最佳提取条件为A3B3C2D1E2。由表10可知,5个因素对人参茎叶总皂苷提取率皆无显著性影响。但从表中可以看出,因素A和因素B的影响明显高于其他3个因素。结合上述结果及节约能源和时间、酶的特性等方面考虑,确定最佳提取工艺为A3B3C2D1E2,即:漆酶用量5%,纤维素酶用量5%,甘露聚糖酶用量1%,反应时间2h,反应温度40℃。在此条件下进行验证试验,人参茎叶总皂苷提取率分别为11.75%、11.81%、11.89%,其平均提取率为11.82%。3复合酶法提取人参根和茎叶总皂苷,困难酶辅助法提取人参总皂苷的方法具有耗能少,提取率高,操作简单等特点。无酶条件下人参根中总皂苷的提取率为3.22%,而复合酶最佳工艺的提取率为5.50%,总皂苷产率较无酶时提高近1倍。无酶条