玉米b-1926的应用研究

玉米b-1926的应用研究

bt-176是一家开发的抗虫、耐草、耐寒的混合玉米品种。美国农业部(USDA)1994年受理该公司的申请,并于1995年批准在美国国内无限制种植。随后,日本(1996)、加拿大(1996)、阿根廷及欧盟各成员国(1997)也先后准许无限制种植,Bt-176玉米的种植面积不断扩大。同时,美国(1995)、加拿大(1995)、日本(1996)及英国、丹麦、荷兰、瑞士和阿根廷等国分别批准Bt-176玉米作为食物或饲料来源并可上市销售。与此同时,Bt-176玉米食用安全问题也受到日益关注,尤其是导入抗性基因及其表达蛋白对人类健康有目的或非目的影响和营养价值改变等问题为各国政府、研究机构及普通消费者关注的焦点。近年来,有关Bt-176玉米食用安全性评价的研究报道不断出现,美国FDA、加拿大卫生部,澳大利亚—新西兰食品管理局(ANZFA)以及欧盟管理部门等也进行了一系列的安全评价。本文旨在介绍这方面的主要研究结果和最新进展,以期为其他转基因植物食用安全性研究提供参考价值。1bt-17玉米在草铵膦玉米中的表达转基因抗虫玉米Bt-176是利用基因工程技术分别将苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)亚种kurstaki的Cry1A(b)基因、土壤细菌Streptomyceshygroscopicus的bar基因等外源基因导入玉米中而获得的抗玉米螟(Ostrinianubilalis,ECB)和耐草铵膦(phosphinothricin)转基因品种。Cry1A(b)基因表达产生特异性杀虫晶体蛋白(insecticidalcrystalproteinICP)在特定pH条件下激活,通过与昆虫中肠上皮细胞受体特异结合,导致细胞膜穿孔,同时也可产生毒性协同作用,使整个细胞失去平衡,最终导致昆虫死亡。bar基因主要作为选择性标记物,可产生PAT酶(phosphino-thricinacetyltransferase),提高抗除草剂草铵膦的能力。Bt-176玉米还导入了bla基因,其主要是作为在DNA克隆和重组阶段选择转换细菌的标记物,产生β-内酰胺酶(β-lactamase)可提高抗抗生素氨苄青霉素(ampicillin)的能力。Privalle等(1994)采用ELISA方法测定了Bt-176玉米不同生长期及不同器官Cry1A(b)蛋白的含量(表1)。结果表明,Cry1A(b)蛋白主要存在于叶片和花粉中,其他组织如籽实、根和茎中含有微量毒蛋白,但均低于最小检出量。整株测定结果表明,Cry1A(b)蛋白含量(干重比)在幼苗期最高,随着生长期延续,含量逐渐降低。通过分析Cry1A(b)蛋白占植物总蛋白比例发现,Bt-176玉米在开花期Cry1A(b)蛋白平均量最高,为14.4µg/g蛋白(即占总蛋白含量的0.00144%)。试验发现,Bt-176玉米对草铵膦产生一定的抗性。ELISA法测定结果表明(表1),Bt-176玉米叶片、根、木髓和整株含有微量的PAT,但含量低于最小检出量,籽实和花粉中未检出PAT。Bt-176玉米中PAT含量不及先正达公司开发的专门抗草铵膦玉米品种的1/30。因此,可以认定Bt-176玉米不能作为抗草铵膦玉米品种使用。另外,导入的bla基因仅仅作为启动子,一般不会在植物组织中表达。通过β-内酰胺酶活性测定及Northern印迹法测定结果表明,在Bt-176玉米叶片和花粉的蛋白浸提液中未测得酶活性,也未检测出blamRNA的转录产物,表明bla基因在Bt-176玉米没有表达。2中毒的研究2.1产品毒性分析2.1.1对克氏原螯虾的急性毒性试验苏云金芽孢杆菌(Bt)δ-内源毒素(即晶体蛋白)作为杀虫剂,自1938年在法国登记商品化生产以来,目前已成为世界上用途最广、产量最大微生物杀虫剂。目前已鉴定了82个亚种,并命名了184个亚类的基因,Cry1A(b)蛋白为其中一类。迄今为止尚无苏云金芽孢杆菌δ-内源毒素对人体健康产生毒害作用的报道。由于目前已知的蛋白毒素均是产生急性毒性作用,因此Cry1A(b)蛋白毒理学研究主要局限于急性毒性试验。Cry1A(b)蛋白对鳞翅目昆虫具有特异活性作用,而对非靶标昆虫、鸟类、鱼类及哺乳动物不起作用。大鼠活体经口试验以及大鼠、小鼠、恒猴和人体体外试验表明,供试物没有Cry1A(b)蛋白结合作用部位(Notebornetal.1995)。J.O.Khun(1994)对苏云金芽孢杆菌kurstaki亚种HD1-9的内源Cry1A(b)蛋白及Bt-176玉米Cry1A(b)蛋白分别进行了小鼠急性经口试验。内源Cry1A(b)蛋白染毒剂量为5050mg/kg体重(Cry1A(b)蛋白含量占70%),Bt-176玉米叶片蛋白浸提液Cry1A(b)蛋白染毒剂量5050mg叶片蛋白/kg体重(Cry1A(b)蛋白含量为0.07%),即Cry1A(b)蛋白剂量为3.54mg/kg体重。每组试验雌雄小鼠各5只。试验结果表明,内源Cry1A(b)蛋白处理组在14天试验期内动物未死亡,但染毒后第1天出现被毛蓬松等中毒症状,染毒1周后1只雌鼠体重降低,其他动物未见异常,动物剖检亦无异常,因此内源Cry1A(b)蛋白急性经口LD50大于3535mg/kg体重。叶片蛋白浸提液Cry1A(b)蛋白染毒处理组在14天试验期内,2只动物因灌胃操作失误死亡,其余处理动物未见死亡,但出现临床中毒症状,主要表现为被毛蓬松、流泪、多尿、上睑下垂和少动等。除被毛蓬松症状外,4天后均恢复正常。动物剖检未见异常。在叶片蛋白浸提液对照组中,处理5天后出现被毛蓬松和少动等症状,2只雌鼠体重略有下降,动物剖检未见异常。因此认为Bt-176玉米叶片蛋白急性经口LD50大于5050mg叶片蛋白/kg体重,即Cry1A(b)蛋白LD50大于3.54mg/kg体重。2.1.2急性经口毒性试验鉴于PAT的特点,1997年美国EPA准予在PAT及其产物登记时不制订最大容许残留水平。由于Bt-176玉米表达的PAT蛋白含量很低,组织提取量无法达到有关试验的含量要求,一般多从E.coli中提取表达的PAT蛋白进行试验。Merriman(1996)对PAT蛋白进行了小鼠14d急性经口毒性试验。试验设51%PAT蛋白的羧甲基纤维素溶液和加热处理的52%PAT蛋白的羧甲基纤维素溶液两个处理,同时以羧甲基纤维素溶液为溶剂对照。剂量为5050mg总蛋白/kg体重,折纯剂量为2575mgPAT蛋白/kg体重。试验期间1只雄鼠因样品中固形物颗粒堵塞食管死亡。溶剂对照组1只雄鼠出现轻微被毛蓬松症状。其他动物未见异常,动物剖检亦无异常,PAT蛋白急性经口LD50大于2573mg/kg体重。2.2bt-17玉米蛋白与b.n-端氨基酸序列及营养评价致敏性是食品安全性评价中重要内容之一。尽管目前还没有成熟的方法测定蛋白质的潜在致敏性,但大多数过敏原具有共同特征,即多为糖基化蛋白,分子量10～70kD,加热稳定,以及胃蛋白酶、胰蛋白酶作用及酸性环境中不易分解等特征。因此通过氨基酸序列分析和特征分析,比较待测蛋白与已知过敏原相似性是确定其潜在致敏性有效手段。苏云金芽孢杆菌是广泛分布的土壤微生物,普遍存在于作物周围。晶体蛋白作为广泛使用的杀虫剂,尚无人体过敏的报道。Bt-176玉米表达的Cry1A(b)蛋白分子量为65kD,N-端氨基酸序列与晶体蛋白一致,具有同源性,糖基化和乙酰作用化测定亦为阴性。试验结果表明(Notebornetal1995,Sandersetal1998),Bt-176玉米表达的Cry1A(b)蛋白在体外肠道模拟中可迅速降解,处理5～10min后已检测不出Cry1A(b)蛋白。通过序列分析的比较表明,Cry1A(b)蛋白与已知过敏原没有生物学意义上的相同性。bar基因源自Streptomyceshygroscopicus,动、植物体内本身不含有bar基因表达的PAT蛋白,因此在食品中不含有PAT蛋白。但Streptomyceshygroscopicus也是广泛分布的土壤微生物,普遍存在于作物周围,不排除PAT蛋白混杂在食物的可能性。体外试验表明,在模拟肠道液体(simulatedgastricfluid,SGF)中,PAT蛋白(3.2mg/ml胃液素)迅速降解,半衰期在1～2min之间。PAT蛋白为热敏性蛋白,在37℃下培养10min,其活性即降低44%。通过与GenBank数据库中已知过敏原氨基酸序列比较,没有发现PAT蛋白与已知过敏原和毒素生物学意义上的一致性。因此,通过上述分析,表明PAT蛋白在哺乳动物肠道中温度、pH值和肽酶作用下,被迅速破坏分解,不会对人体产生致敏作用。3收养特征3.1各变量之间的差异组分分析(proximateanalysis)试验结果表明,Bt-176玉米与同源对照玉米相比,籽实主要成分没有明显的差异(表2)。同时发现不同品种之间在个别指标具有统计学意义上的显著差异,但这种差异性变化没有规律性,而且变化均在文献资料范围之内,因此这些差异与基因导入没有必然联系。通过测定玉米籽实16种氨基酸含量发现,除脯氨酸和甘氨酸显著增加(P>0.05)外,Bt-176玉米与同源对照玉米相比,没有明显变化。而且变化均在文献资料范围之内。研究结果还表明,Bt-176玉米籽实5种脂肪酸(棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸及亚麻酸)和类胡萝卜素(叶黄素、β-胡萝卜素)含量没有明显差异性的变化,测定值均在文献报道的范围之内。3.2玉米籽实及其类物抗营养物质通常是指可抑制或阻碍代谢尤其是消化过程中重要途径的物质,食物中含有一定抗营养物质可降低营养物质的利用率和营养价值(Watzl等,1995)。一般认为玉米籽实含有一定的植酸盐及胰岛素和胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)抑制物等抗营养物质(Wright,1987)。基因序列分析研究结果表明,导入Bt-176玉米的基因片段中已剔除表达胰凝乳蛋白酶抑制物的基因位点,同时酶活性测定结果也表明,Bt-176玉米组织内源蛋白酶抑制物活性与对照没有差异,说明Bt-176玉米组织胰凝乳蛋白酶抑制活性没有变化。4抗虫玉米bt-17b通过对转Bt基因玉米品种Bt-176基因转化特征、毒理学和营养学的分析和评价,可以得到如下结论:Bt-176玉米是通过导入苏云金芽孢杆菌kurstaki亚种的Cry1A(b)基因和土壤细菌Streptomyceshygroscopicus的bar基因而获得的抗虫抗草铵膦的的玉米品种,对鳞翅目害虫如欧洲玉米螟(EuropeanCornBorer,ECB)具有特定毒性。但不具有抗草铵膦的能力。检测结果表明,Cry1A(b)蛋白主要分布于叶片和花粉,在玉米籽实中含量低于5ng/g鲜重。PAT蛋白没有检测到,blagene在玉米中没有表达。玉米一般不含天然毒素或过敏原,是人类长期食用的安全食品。苏云金芽孢杆菌的晶体蛋白作为杀虫剂已长期使用,证明也是安全的。小鼠急性经口毒性试验表明,Cry1A(b)染毒剂量大于3535mg/kg,PAT染毒剂量大于2575mg/kg时,均未见中毒症状。