酵母双杂交系统检测蛋白质的研究进展

酵母双杂交系统检测蛋白质的研究进展

1989年，伦琴提出并建立了一种新的遗传方法，以直接检测母系细胞中的蛋白质相互作用。这一技术在细胞周期与分化、细胞凋亡、信号转导、癌基因产物功能、基因表达调控及蛋白自身特性等研究领域,受到越来越多的关注。随着该技术的发展和研究的深入,衍生出酵母单杂交、三杂交、反向双杂交等体系。其应用范围扩展至蛋白质与蛋内质、蛋白质与DNA、RNA及与其它小分子相互作用的研究,对新作用蛋白的发现,蛋白间相互作用网络的认识,甚至对整个蛋白质组(proteome)的研究起到巨大推动作用。1经典的双重均混合系统1.1抑制剂序列的激活酵母双杂交系统的建立基于对真核生物调控转录起始过程的认识。参与这一过群的转录激活因子在结构上是组件式的(modular),往往由两个(或两个以上)相对独立的结构域组成,即DNA结合结构域(bindingdomain,BD)和转录活化结构域(activitiondomain,AD)。两结构域建立空间联系是转录激活的关键,而单独作用无法激活转录过程。分别将拟研究的猎物(prey,或称靶蛋白)蛋白的基因与编码AD的序列结合,诱饵(bait)蛋白的基因与编码BD的序列结合,形成两段融合基因。当两段融合基因通过载体质粒转入同一酵母细胞表达时,分别生成融合蛋白prey-AD与bait-BD。借助诱饵蛋白与靶蛋白在核内的相互作用,分离的AD与BD在空间上得以接近,形成完整的有活性的转录因子,进而与上游激活序列(upstreamactivatingsequence,UAS)结合,激活相应报告基因(reportgene)获录。反过来,报告基因的表达与否,可判断靶蛋白与诱饵蛋白之间是否相互作用。通过简单的酵母遗传分析,对报告基因进行检测,即可实现对蛋白间相互作用的分析。1.2真核酵母模型(1)采用酵母作为报道株,菌株生长速度快,步骤简洁,容易操作。(2)敏感度高。许多微弱或短暂的蛋白之间的相互作用,借助报告基因表达过程中多级放大效应反映出来。(3)在真核酵母活细胞内进行,蛋白易于保持天然折叠状态,更接近体内真实水平。(4)酵母有许多营养缺陷标记,结果易于筛选。(5)应用范围比较广泛。1.3基因治疗中蛋白间相互作用的检测(1)寻找与靶蛋白相互作用的蛋白,尤其是筛选cDNA文库。(2)特异地检测已知蛋白间相互作用。(3)确定蛋白相互作用的部位甚至关键氨基酸。(4)确定蛋白之间弱相互作用。(5)确定基因治疗中多肽类药物作用机制。(6)建立蛋白相互作用图谱。2母乳喂养系统的不足和对策2.1蛋白质作用系统融合蛋白必须转至核内才能活化转录,这是影响双杂交系统进一步推广的主要障碍。对于胞外受体-配体作用,以及需要核外加工修饰等翻译后介导的蛋白质作用而言,该系统应用受到限制。一般而言,膜蛋白也不适于此,已出现通过改变某些细胞膜定位序列,在载体中添加核定位信号序列的方法以及专门研究非核内蛋白作用的系统。2.2菌株的筛选和检测指诱饵和靶蛋白在没有发生作用的情况下,报告基因被激活。进行文库筛选时,这是最常见的干扰实验准确性的问题。(1)靶蛋白本身含转录活化成分(如可结合报告基因上游DNA),即prey-AD自身可激活报告基因转录。(2)诱饵蛋白本身有激活作用。对以上情况,可通过严格对照实验,排除假阳性。对诱饵和靶蛋白分别作单独活性报告,不失为一好方法。(3)prey-AD对bait-BD无特异性,与无关的DNA结合域杂交体共转化酵母亦表现阳性。在筛出阳性克隆后,将Prey-AD与无关DNA结合域杂交体作共转化酵母测试,以排除假阳性。Harper采取一种快速鉴别假阳性的方法:用选择性培养基去除阳性克隆的bait-BD质粒,只剩prey-AD质粒,与不同性别的含无关DNA结合域杂交体的酵母交配,以二倍体酵母是否表现阳性来鉴别假阳性。省去了回收质粒共转化酵母的烦琐步骤。(4)由于未被发现的调控途径激活报告基因,这种假阳性需用其它实验排除。(5)假阳性也可能是双杂交设计的原因:cDNA库的构建中,如使用随机引物,可能使蛋白中一些非暴露区域暴露,并被筛选出来;一对不在同一时间、同一种组织表达的蛋白可能发生作用,而不是生理意义上的作用。(6)某些蛋白是依赖于遍在蛋白的蛋白酶水解途径成员,它们具有普遍蛋白间相互作用能力。可判定相互作用的特异性并增大蛋白信息量,有助于去除假阳性结果;将报告基因整和到染色体上,可使基因表达水平稳定,消除因质粒拷贝数变动对结果的影响。另外,可用免疫共沉淀的方法鉴定结果。2.3水资源的制备2个蛋白之间本应发生相互作用,但报告基因不表达成表达程度低检测不到。尽管非实验中主要问题亦应重视。常见原因:(1)融合蛋白对细胞有毒性。这时,应选敏感性低的菌株或拷贝数低的载体,采取共转化的方法也可以降低毒性。(2)对于蛋白间相互作用效弱,则应选高敏感菌株或高考贝载体。2.4使用小体诱导蛋白如何提高转化率是文库筛选成败的关键,尤其是低丰度cDNA文库筛选,必须提高转化率。(1)共转化较依次转化省时省力,并可减弱或消除融合表达蛋白对酵母毒性。(2)酵母两性接合是更为有效的方法,将诱饵蛋白载体与靶蛋白载体分别转入不同接合型单倍体酵母中再杂交,将诱饵蛋白与靶蛋白带入同一二倍体细胞中。Fromont-Racine等人对这一技术作了进一步改进,用于蛋白质组研究。以10种与mRNA前体剪接有关的蛋白作起始“诱饵”,从5×105个克隆的酿酒酵母基因组文库中先后进行3轮15次筛选,最终从700个阳性克隆中得到剪切因子(新发现5种)及其他相关因于67种。(3)构建文库也非常重要,已出现采用体内重组技术达到目的的方法。3关于母亲饲料系统的进一步发展和展望3.1蛋白质间相互作用的鉴定哺乳动物细胞作为宿主的双杂交体系也在不断改进和推广,酵母细胞中不能完成的某些蛋白产物修饰过程得以弥补,使蛋白间作用更接近体内实际情况。中国地鼠卵巢细胞(CHO)、非洲绿猴肾(COS)等细胞是较成熟的哺乳细胞宿主。除表型筛选外,测定放线菌酮乙酰转移酶活性来鉴定蛋白间结合程度成为常规手段。因为此系统能更好地模拟细胞内环境,因而利于探明蛋白相互作用的机制。3.2增加结合ndv的分子序列Wang和Rddd基于酵母双杂交系统提出单杂交系统,用于研究DNA-蛋白质间相互作用。不同之处仅在于它省略了双杂交系统中bait-BD蛋白杂交体,代之以具有蛋白重要结合位点的DNA。可利用DNA序列捕获具有与之特异结合的结构域的蛋白质。该体系最适于研究参与基因转录和复制的蛋白质。可用于确定已知DNA-蛋白质之间相互作用;获取能与顺式作用元件结合的反式作用因子;准确定位蛋白的DNA结合结构域以及结合的核酸序列。Wei等采用酵母单杂交体系确定了特异性结合于海胆胚胎孵化酶(SpHE)基因调控区域的反式作用因子SpEst4。酵母单杂交系统灵敏性高,可直接获得与DNA特异结合的蛋白质的基因序列。与双杂交系统类似,也同样会出现假阳性和假阴性的问题,有待进一步完善。3.3蛋白间相互作用三杂交系统是SenGupta等发展起来的,与双杂交系统原理相似,只是两杂交蛋白结合需通过第3个分子介导。三杂交系统必须满足:两蛋白无直接作用,必须通过第3个成分才能激活转录;第3个分子具有结合两蛋白的位点。许多细胞内信号传递过程中,两蛋白间相互作用涉及第3个分子。基于此,三杂交系统用于研究蛋白与RNA、与多肽及其它小分子间的作用,大大扩展了酵母双杂交系统的应用范围。Zhang等利用三杂交系统首先研究了表皮生长因子(EGF)受体、Grb2和鸟嘌呤核酸交换蛋白(SOS)3种蛋白间相互作用。Bacharach用此系统发现HIV1Gag蛋白可特异性与衣壳信号的含4个茎环结构的139个核苷酸的RNA结合。酵母三杂交系统较双杂交系统应用更广,但对于不易穿膜难于进入酵母细胞的分子不适用,同样不适合膜蛋白的研究。3.4基于蛋白间相互作用酵母双杂交系统创立的初衷是研究蛋白间相互作用,如果这种作用很重要,那么解离这种作用必然导致对生物的重大影响,而研究阻断蛋白间相互作用的因素也就很重要。如研究如何阻断癌基因产物与宿主蛋白间相互作用,以及癌细胞间信息传递。逆向双杂交系统由Shih等创立,可作为酵母双杂交系统较好的补充。与酵母双杂交系统比较,突出的特点在于构建一种反向筛选报告基因,即蛋白间特异相互作用所激活的报告基因能阻碍转化体(宿主菌)的生长,从而发现蛋白间结合的解离因素。Shih等用该系统对阻断环腺苷酸(cAMP)效应分于结合蛋白与辅助因子相互作用的诱变剂进行了研究。Vidal等据此发现了影响转录因子E2F1中与DP1相互作用的点突变。另外,还有双诱饵系统,而分离的泛素系统、蛋白片段互补分析、阻遏物重构分析及研究膜蛋白的SOS恢复系统等非转录筛选系统,是利用蛋白质的其它结构特点来建立的全新系统,不依赖转录因子活性