硅藻中藻蓝蛋白的分离纯化研究

硅藻中藻蓝蛋白的分离纯化研究

来自薄面的螺旋含有丰富的蛋白质、维生素、矿物和糖苷。蛋白质含量达到干质量的50%70%，其中藻蓝蛋白含量最高，占细胞干燥质量的25%28%以上。藻蓝蛋白是一种重要的天然光合色素,作为无毒且无副作用的理想光敏剂,应用于食品、化妆品及染料等工业;同时藻蓝蛋白还具有改善免疫系统功能、促进动物血细胞再生和抑制癌细胞等作用。本文探索了硫酸铵反复梯度盐析结合双水相分离纯化钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的工艺条件。1试验材料和方法1.1peg4000、柠柠檬酸钠、氯化钾的测定钝顶螺旋藻粉购于昆明云绿生物科技有限公司,水为重蒸馏水,硫酸铵、PEG4000、柠檬酸钠和氯化钾均为分析纯。UV765型紫外可见分光光度计、ALC700SC–2S-K6型电子天平、HJ-3型恒温磁力搅拌器、800型离心机、DKB-501型超级恒温水槽及JJ-2型电动搅拌器。1.2方法1.2.1计算单相系统海藻蛋白分配系数k的方法式中:Cpc,t、Cpc,b分别代表藻蓝蛋白在萃取后双水相上、下相中的浓度;A620代表藻蓝蛋白在波长为620nm处的吸光度值。1.2.2紫外-可见光谱测定细胞外冰粒时总条件下提取细胞内冰粒时细胞液的制备方法准确称取钝顶螺旋藻粉24.0g和无水氯化钙3.0g置于烧杯中,加蒸馏水300mL,在-21℃条件下冷冻,4℃下融解,反复3~4次,利用细胞内冰粒的形成和细胞液盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎,螺旋藻破碎混合液于3600r/min条件下离心30min,上清液在230~710nm波长范围内测定紫外-可见光谱。1.2.3盐析法提取藻蓝蛋白1.2.3.硫酸铵分级沉淀分别取破壁后的螺旋藻溶液10mL于12支试管中,依次加硫酸铵至饱和度为10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、75%和100%的硫酸铵溶液,4℃静置12h。10%、20%和25%饱和度的硫酸铵液在3600r/min条件下离心30min,取上清液,弃去沉淀;30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、75%和100%饱和度的硫酸铵液在3600r/min条件下离心30min,取沉淀物,弃去上清液,沉淀用PBS缓冲液溶解,测定溶液在620nm和280nm的吸光度值,计算藻蓝蛋白纯度A620/A280。1.2.3.硫酸铵分级盐析8h-酸铵分级沉淀蛋白的检测取适量破壁后的螺旋藻液在3600r/min条件下离心20min,取沉淀,用25%饱和度的硫酸铵液4℃盐析10h除杂蛋白后,加硫酸铵至饱和度50%,4℃沉淀蛋白10h,沉淀用饱和度20%的硫酸铵4℃盐析8h除杂蛋白,上清液追加硫酸铵至饱和度45%,4℃盐析8h沉淀,再用饱和度10%的硫酸铵液4℃盐析8h除杂,上清液追加硫酸铵至饱和度为35%,再在4℃盐析4h沉淀,沉淀用PBS缓冲液溶解,在230~710nm下测定紫外-可见吸收光谱。1.2.4藻蓝蛋白双水相系统分配将适量的柠檬酸钠、PEG和蒸馏水混合,搅拌,使成相物质溶解均匀,加入适量破壁后的螺旋藻液,继续搅拌完成藻蓝蛋白在双水相系统中的分配过程。4℃静置10h,使上下两相达到完全分层,分别取上下相的溶液,测定吸光度A620和A280,计算纯度A620/A280和分配系数K。1.2.5双水相系统分液器分离取1.2.3.2下反复盐析后的藻蓝蛋白溶液置分离效果良好的一定质量比的PEG、柠檬酸钠和氯化钾组成的双水相系统分液漏斗中,4℃静置10h后,两相完全稳定分离,吸取上相溶液,测定吸光度A620和A280,计算纯度A620/A280。2结果与讨论2.1采用硫酸铵盐法分离藻兰蛋白2.1.1藻蓝蛋白测定值由图1可知:藻蓝蛋白溶液在280nm和620nm处有最大吸收波长,和文献报道一致,螺旋藻蛋白在280nm处有最大吸收峰,藻蓝蛋白在620nm处有最大吸收峰,冻融破壁后螺旋藻溶液中藻蓝蛋白纯度为0.4,其中螺旋藻杂蛋白含量较多。2.1.2%饱和度硫酸铵盐析藻蓝蛋白纯度变化由图2可知:10%~30%饱和度硫酸铵盐析得到的藻蓝蛋白纯度较低,30%~45%饱和度硫酸铵盐析藻蓝蛋白,藻蓝蛋白纯度逐渐增加,大于45%饱和度硫酸铵盐析藻蓝蛋白纯度变化不大。确定:10%~30%之间的硫酸铵饱和度可以用来除去大量螺旋藻杂蛋白,大于40%饱和度的硫酸铵用于沉淀藻蓝蛋白和藻蓝蛋白的富集纯化。2.1.3藻蓝蛋白的纯化由图3和图4可知:一步硫酸铵盐析后主要去除350~500nm处有吸收的螺旋藻杂蛋白,藻蓝蛋白的吸收峰值有一定提高,在螺旋藻蛋白中占据的比例相应增大,藻蓝蛋白得到了一定的纯化,但280~340nm处有吸收的螺旋藻杂蛋白并没有被除去,有待于进一步纯化;硫酸铵六步盐析后,螺旋藻杂蛋白被进一步除去,尽管还有低的吸收峰,但所占比例相应减少,藻蓝蛋白得到了进一步纯化,纯度达3.1。2.2两个水相系统的组成对藻蓝蛋纯度和分配系数的影响2.2.1藻蓝蛋白分离纯度的确定用一定质量分数的不同平均分子质量的PEG和一定质量分数的柠檬酸钠组成的双水相系统分离硫酸铵盐析后纯度为0.8的藻蓝蛋白,研究不同平均分子质量PEG组成的双水相系统对藻蓝蛋白分离纯度的影响,试验结果见表1。由表1可知:PEG平均分子质量对双水相系统平衡的影响较大,PEG平均分子质量越低,水溶性越好,成相的临界浓度高,即在相同的聚合物和无机盐浓度下,PEG平均分子质量低的溶液不能形成双水相体系,PEG平均分子质量增大,容易形成双水相体系,而分子质量过大对藻蓝蛋白纯度提高不明显,确定平均分子质量4000的PEG组成分离藻蓝蛋白的双水相系统。2.2.2peg4000质量分数的影响用不同质量分数的PEG4000和一定质量分数的柠檬酸钠组成的双水相系统分离硫酸铵盐析后纯度0.8的藻蓝蛋白,研究不同质量分数PEG4000组成的双水相系统对藻蓝蛋白分离纯度的影响,试验结果见表2。PEG4000质量分数从4%增加到18%时,藻蓝蛋白纯度从1.72先增加到1.73,然后下降,分配系数K从2.64增加到8.31。在双水相系统分离藻蓝蛋白纯度变化不大的状态下,分配系数变化较大,从双水相分离藻蓝蛋白纯度的角度考虑,确定PEG4000的质量分数为8%。2.2.3不同试验结果用8%质量分数的PEG4000和不同质量分数的柠檬酸钠组成的双水相系统分离硫酸铵盐析后纯度0.56的藻蓝蛋白,研究不同质量分数柠檬酸钠组成的双水相系统对藻蓝蛋白分离纯度的影响,试验结果见表3。由表3可知:在柠檬酸钠质量分数10%~24%的范围内,随着柠檬酸钠质量分数的增加,藻蓝蛋白分离纯度从1.49增加到1.705后下降;藻蓝蛋白的分配系数K也随柠檬酸钠质量分数的增加呈现先增加后减小的变化趋势;相比随柠檬酸钠浓度的增加而显示下降变化。当柠檬酸钠质量分数是16%时,藻蓝蛋白分离纯度为1.705,分配系数K为5.02;当柠檬酸钠的质量分数为20%时,藻蓝蛋白的分离纯度为1.684,分配系数K为5.16。从双水相分离藻蓝蛋白纯度的角度考虑,确定柠檬酸钠质量分数为16%。2.2.4藻蓝蛋白分离纯度的确定在质量分数8%的PEG4000和16%的柠檬酸钠组成的双水相系统中加入不同质量分数的氯化钾后分离硫酸铵盐析后纯度为0.56的藻蓝蛋白,研究不同质量分数氯化钾提供的不同离子强度环境下双水相系统对藻蓝蛋白分离纯度的影响,试验结果见表4。由表4可知:在氯化钾质量分数0%~8%范围内,随着质量分数的增大,藻蓝蛋白的纯度呈现先增大后减小的趋势,当KC1质量分数为4%时,藻蓝蛋白分离纯度最大,为1.701,相比为0.446,分配系数为2.00,确定加入4%质量分数的KC1组成分离藻蓝蛋白的双水相系统。2.3藻蓝蛋白的纯化取经2.