污染区稻麦籽实中cd形态的分析

污染区稻麦籽实中cd形态的分析

食品中的重金属形状与环境不同。虽然它不是一个简单的武器状态，但它通常与食物成分结合，并呈现各种形状。它的生物吸收性和毒性与金属无产阶级有很大不同。这方面的研究仍然很薄弱。关于鱼类、虾、贝等刺激性食品中重金属的存在，但对粮食等植物园中重金属的存在还缺乏系统的研究。作者采用了组织化学和溶剂提取法，探讨了水稻麦粒的分布以及cd-pb与各种营养成分的结合。1材料和方法1.1样本来源稻麦籽实采自湖北大冶铜矿区及云南兰坪铅锌矿区周围农田收获样品.1.2提取脂肪以提取种子按国家标准方法(GB2906-82)提取籽实中粗脂肪,并计算粗脂肪含量.1.3上清液的提取将脱脂后的稻麦籽实样品,按样品溶剂1:10的比例进行连续提取,提取顺序为去离子水5%NaCl70%乙醇0.2%NaOH.其方法是搅拌1h后置于冰箱内10h,6000r/min离心30min,取上清液,沉淀部分进行下一提取剂的提取.1.4样品处理与蛋白质标准曲线的绘制将稻麦籽实粉碎后,按文献方法脱去脂肪,风干后称取适量,用0.05MTris-HCl(pH7.5)进行提取,样品与提取液之比为1:10.将提取液样品置于冰箱内10h后,在20000r/min的高速冷冻离心机中离心1h,取上清液于冰冻干燥箱内浓缩5倍.取浓缩样品1mL用0.05molTris-HCl溶解,经SephadexG75柱进行层析分离(2.0×100cm).用0.02molTris-HCl缓冲液(pH7.5)进行洗脱.用自动部分收集器(BS2-100)以4mL/20min的流速,每管4mL收集洗脱液.紫外分光光度计(BECKMANDU-8B)测定洗脱液的紫外吸收峰(225nm处),并同步测定洗脱液中的Cd浓度.用标准蛋白质曲线法测定洗脱液样品分子量.标准蛋白质为牛血清蛋白(分子量66000)鸡卵清蛋白(分子量45000)胰蛋白酶(分子量24000)细胞色素C(分子量12400),均为层析纯.将标准蛋白质混合液与样品相同的方法经SephadexG75柱层析,绘制蛋白质标准曲线.1.5氨基酸测定按GB7649-87方法,用Biochrom20氨基酸分析仪(瑞典)分析洗脱液样品中17种氨基酸含量.1.6分析含量测定将待测样品经硝酸高氯酸消化后用石墨炉原子吸收分光光度计(GBC906,澳大利亚)测定其含量.为保证分析方法的准确性,采用国家标准样品进行质量控制.2结果与讨论2.1cd与脂肪的含量及其分布通过提取法测定了稻米麦粒中脂肪和蛋白质中Cd的含量和抽提脂肪蛋白质后剩余残渣中Cd含量,残渣主要成分是淀粉少量的纤维素半纤维素和矿物质(对这些成分未作进一步分离),结果见表1.由表1可看出,两种作物籽实中均以蛋白质中Cd的浓度最高,残渣次之,脂肪中浓度很低.从籽实中Cd的总量分布看,以蛋白质中的分布比例最高,可占60.58%和67.67%,残渣中占39.02%和32.29%,脂肪中所占比例极低.值得指出的是尽管稻麦籽实中的蛋白质仅占其营养成分的8%和11%,但其中Cd的总量分布却占据绝对优势,由此表明Cd在籽实中主要呈现与蛋白质结合的形态,这与笔者采用组织化学法及溶剂提取法的实验结果一致.此外,残渣中还有一定浓度的Cd可与纤维素半纤维素等生物成分相结合.而与脂肪的结合量甚微.2.2cd在稻麦籽实中的浓度种子蛋白质大部分为储藏蛋白质属简单蛋白质.根据其在各种溶剂中的溶解度不同,可分为清蛋白醇溶谷蛋白球蛋白和谷蛋白.清蛋白溶于水,在加热或某种盐类的饱和溶液中发生沉淀,主要是酶蛋白,在水稻及小麦种子蛋白质中分别占5%和9%;球蛋白不溶于水但溶于盐类溶液,在禾谷类种子中普遍存在,在水稻种子蛋白质中占10%,小麦中占5%;醇溶谷蛋白不溶于水和盐类溶液,但溶于70%酒精溶液,是禾谷类特有的一种蛋白质,在大部分禾谷类种子中都存在,占水稻种子蛋白质的5%,小麦种子蛋白质的40%;谷蛋白不溶于水盐类和乙醇溶液,但溶于稀碱或稀酸溶液,在禾谷类种子中普遍存在,尤以水稻种子中为最高,可占种子蛋白质的80%,小麦种子中占46%.根据以上性质采用1.3方法对稻麦籽实中这4种类型蛋白质进行了连续提取,并测定了提取液中Cd的浓度(图1).结果表明,两种作物籽实蛋白质中均以球蛋白和谷蛋白中Cd的分布比例最高.稻米球蛋白中Cd占42.13%,小麦占44.06%;稻米谷蛋白中Cd占38.94%,小麦占26.48%.醇溶性谷蛋白中Cd的分布比例最低,水稻占4.05%,小麦占6.9%.根据两种作物各类型蛋白质的一般分布比例及各类型蛋白质提取液中Cd的浓度可计算出各类型蛋白质结合Cd的浓度(表2).结果表明,Cd在不同类型蛋白质中的浓度有明显差别,两种作物均以球蛋白中为最高,其次是清蛋白,谷蛋白和醇溶性谷蛋白中的浓度较低.上述Cd在籽实蛋白质中的总量分布是以球蛋白和谷蛋白为高,由表2可见前者与其浓度较高有关,而后者则由于其占蛋白质总量的比例较高所至.然而,各类型蛋白质中Cd的浓度更加直接反映了其结合状况,即说明Cd在稻麦籽实中更易于与球蛋白和清蛋白相结合.这两种蛋白质为可溶性蛋白质,分子量较小.需指出的是以上结果是在假设提取的蛋白质为纯蛋白质的前提下计算得出的,未进行分离提纯.由于球蛋白可微溶于水,故水溶性蛋白质提取液中除清蛋白外可能有微量球蛋白存在;在水溶态及醇溶态中也不排除可溶性糖的存在,但鉴于大多数禾谷类种子中可溶性糖的含量均较低,一般占干物质的2%～2.5%,由此反映了Cd与种子中不同类型蛋白质的结合趋势.另外,可溶于水的清蛋白中Cd的浓度较高,其中是否存在游离态Cd有待于研究.2.3cd的紫外吸收脱脂稻麦籽实样品用0.05molTris-HCl缓冲液提取,并将提取液经SephadexG75柱进行凝胶层析,对洗脱液进行紫外吸收测定并同步进行Cd浓度分析,其结果见图2.糙米的Tris-HCl可溶性组分经SephadexG75柱分离得到3个明显的紫外吸收峰,分别出现在洗脱液第15管(I峰)31管(II峰)和44管(III峰)处,尤以第III峰为高.从其在225nm处有紫外吸收的特性判断其为蛋白质稀溶液(或多肽类物质).经与相同条件下的蛋白质曲线对照这3个峰的表观分子量分别为54.5×10316.04×1035.5×103.从洗脱液中Cd的测定结果看,出现了3个明显的Cd峰,其出现位置恰与IIII紫外吸收峰相重合.第II紫外吸收峰也含Cd,但Cd的富集不显著.由此推断,糙米中Cd-蛋白质(多肽)结合体的表观分子量为54.5×103和5.5×103.麦粒Tris-HCl可溶性组分的凝胶层析结果与糙米类似(图2),也得到3个蛋白质紫外吸收峰,出现在洗脱液第14管(I峰)27管(II峰)和44管处(III峰),以第I峰的紫外吸收值最高.与标准蛋白质相对照,3个峰的表观分子量依次为54.5×10320.17×103和5.5×103.洗脱液中Cd的测定结果表明,第IIII紫外吸收峰为富Cd峰,II峰中也有一定浓度的Cd存在.说明麦粒中Cd-蛋白质(多肽)结合体的表观分子量与糙米相同,也为54.5×103和5.5×103,20.17×103处也含有Cd,但富集不明显.此外在洗脱液第39管处还有一个含Cd的峰,但未与紫外吸收峰峰相重合,其结合形态尚待研究.2.4麦粒氨基酸组分的氨基酸组成为进一步了解Cd-蛋白质结合体的氨基酸组成,对经凝胶层析分离得到的3个蛋白质(多肽)的17种氨基酸组成进行了分析,其结果见表2.从表2看出,糙米麦粒3个蛋白质组分均未出现极端组成状况.糙米富Cd的第IIII蛋白质组分的氨基酸组成有明显相似趋势,均以GluValIleLeuArgCys的含量较高,这6种氨基酸之和可占氨基酸总量的63.4%和66.02%(图2中IIII组分),这两个组分中的Pro未检出,Ser和Thr的含量较低.含Cd量较低的第II蛋白质组分的氨基酸组成与IIII的主要区别是Glu的含量明显要低.从表2中麦粒的3个蛋白质组分的氨基酸组成看,富Cd明显的第I组分中,GluValIleLeuTyr和Asp的含量较高,这6种氨基酸合计占氨基酸总量的63.63%,不含Pro,His的含量较低;富Cd明显的第III蛋白质组分的氨基酸组成与I类似,但Glu的含量较低,而Cys的含量比第I峰要高,也不含Pro,Thr的含量较低;含Cd量相对较低的第II蛋白质组分中以GluValIleIeu和Phe的含量较高,这5种氨基酸组合计占氨基酸总量的53.89%,与IIII组分的主要区别是Cys的含量较低,这是具有=S健的氨基酸.以上结果反映了两种作物籽实中富Cd蛋白质氨基酸的表观组成.由于不同作物同一作物的不同品种不同类型蛋白质的氨基酸组成均有一定差异.因此,对前述富Cd蛋白质的类型结构及其稳定性等仍需作进一步研究.3cd在稻麦籽实中的氨基酸组成与分布3.1在稻麦籽实主要营养成分中,Cd以与蛋白质相结合的形态为主,占Cd总量的60%和67%.3.3稻麦籽实Tris-HCl可溶性组分经SephadexG75柱层析表明,Cd-蛋白质结合体的表观分子量为54.5×