酵母双杂交中的蛋白-蛋白相互作用

酵母双杂交中的蛋白-蛋白相互作用

1共表型的制备双混合的原则上是基于对许多真核生物的控制过程的理解。初始点特殊转移激活因素通常有两个相互关联的结构区，即特定字段结构区（cd）和异常字段结构区（ad）。这两个结构域各具功能,互不影响,但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。所以可以将两种蛋白(可以是已知,也可以是未知的)与上面两个结构域建成融合蛋白。将编码已知蛋白质(常称为诱饵蛋白质,baitprotein)的基因与编码DNA结合结构域的序列融合,在酵母中表达产生融合蛋白质称为BD-Bait;编码未知蛋白(常称为捕获蛋白质,preyprotein)的基因与编码转录激活结构域的序列融合,并在酵母中表达产生另一融合蛋白称为AD-Prey。把这两种融合蛋白共表达于宿主细胞中,如果这两个待测蛋白间能发生相互作用,就会通过待测蛋白的桥梁作用,使AD与BD形成一个完整的转录激活因子,并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定,可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。反之,如果待测蛋白间不发生相互作用,则BD和AD不能结合,报告基因的转录不能被激活。如果将Prey换成基因文库,即可直接从基因文库中筛选到能与Bait相互作用蛋白的DNA序列。2母乳喂养系统的应用2.1双杂交互作用的灵敏度利用双杂交系统可用来检测两个蛋白之间是否存在相互作用,只需将编码两个蛋白的DNA序列分别克隆至双杂交系统的载体中,即可通过检测报告基因是否表达,从而论证这两个蛋白是否发生了交互作用。用传统的蛋白检测方法也能验证这种交互作用的发生,但双杂交系统的优点在于它的高灵敏度,而且反映了蛋白在体内的交互作用。如在Aelst等所做的实验中,用双杂交系统能检测出免疫沉淀法无法检测到的Ras-Raf的交互作用,表明双杂交系统具有非常高的灵敏性,能检测出蛋白间微弱的相互作用,这是因为:(1)杂合蛋白一般是由高拷贝质粒的强启动子过量表达的蛋白;(2)双杂交系统能检测出瞬间发生的信号反应,而一般的体外检测法蛋白则要经过一系列洗涤过程,往往导致交互作用不再发生;(3)融合蛋白的交互作用由于BD和DNA序列的相互结合变得更为稳定;(4)在转录过程中产生了一些复合酶使信号放大。在证实两个蛋白形成交互作用后,可以对该蛋白进行缺失实验,通过缺失掉不同的片段来验证该蛋白在双杂交系统中是否仍具有激活转录的功能,从而对蛋白质中起作用的功能进行精确的定位,进而可以在相互作用的最小区域内进行DNA点突变,改变氨基酸序列,再测定突变体是否仍能激活报告基因的表达,从而找到交互作用发生所必需的氨基酸残基。这是双杂交系统的特点所决定的,因为它是在DNA水平上表达蛋白质,只要缺失掉相应的DNA片段即可达到我们的目的,而传统的检测方法则无能为力。另外,通过该方法还能研究蛋白质的结构与功能,例如Li等在p53和SV40大T抗原的结合实验中,对p53进行突变试验,发现突变型的p53失去了和T抗原结合的能力,这与一些癌症患者的p53蛋白发生的突变是一致的。2.3模式1:双杂交蛋白系统这是双杂交系统最广泛、最有价值的应用。将感兴趣的目标蛋白基因克隆至BD载体,而将要筛选的cDNA库克隆在AD载体,共同转化酵母宿主菌,如cDNA序列编码的某一段蛋白能和靶蛋白发生交互作用,则启动报告基因的转录,据此可以找到一个新的结合蛋白,使用双杂交系统筛选到的新蛋白已经相当多,并仍在继续扩大,这些蛋白在信号传导方面很可能扮演了重要角色。例如,由于PKC在细胞的发育和分化中所起的中心作用,Staudinger等将PKC的催化部分克隆到GAL4的BD作为“诱饵”来筛选小鼠T细胞的cDNA库,果然找到了一个新的蛋白PICK1,它和PKC的催化结构域专一性地发生交互作用,并用是PKC磷酸化作用的底物,对PICK1进行深入的研究将会使我们再清楚地了解和PKC有关的信号传导途径。2.4小分子多充皮肤用酵母双杂交系统筛选与某种药物设计目标的蛋白分子相互作用的多肤,则筛选到的分子中可能会含有一些具有药物治疗作用的小分子多肤。Yang等证明了一段Leu-X-Cys-X-Glu肽可以与成视网膜母细胞瘤(Rb)蛋白相互作用,为这项工作打下基础。2.5其他蛋白活性的检测确定两个蛋白质A、B具有相互作用以后,在恢复转录活性的双杂交系统中加入第三种物质C,再定量检测报告基因的表达强度,可以确定C对A、B之间相互作用的抑制或增强。Dixx通过APP蛋白重建了Ga14的转录活性,然后加入蛋白酶检测它是否可以切断蛋白,从而阻断Gal4的转录。若此蛋白酶的作用被证实,则还可加入第4种物质,来筛选蛋白酶的抑制剂。2.6蛋白质-相互作用图谱的建立随着基因组及后基因组计划的研究与发展,及各种mRNA在不同组织器官与生长发育不同阶段的分布(时空分布)图谱的构建,蛋白质相互作用图谱的绘制业已展开。在双杂交的AD与BD质粒中同时连入cDNA文库,进行库-库筛选,结合基因微点阵与生物信息学技术,则可以绘制出网状的蛋白联系图谱。2.7tnf2r家族在细胞毒性检测方面的应用蛋白质间或蛋白质与其他分子间的相互作用是细胞信号转导中重要的信号传递形式。Kiston等利用双杂交系统研究了TNF2R家族的细胞表面受体,发现它们存在一个由70~80个氨基酸构成的保守域,它是引发细胞凋亡(apoptosis)的“死亡区域”,并同时发现了一个新的具有“死亡区域”的TNF2R家族的表面受体WSL21蛋白(DR3/APO23)。Dortay等利用大规模酵母双杂交技术检测出了拟南芥细胞分裂素信号途径中的大多数蛋白质成员间的42种新的相互作用,证明该途径中蛋白质家族之间存在明显的相互作用,而同一家族的蛋白质之间却很少发生相互作用;同时发现相互作用的网络中心是磷酸转运蛋白,它与所有其他蛋白质家族的成员都发生相互作用。3“vitro”与酵母双杂交系统的比较传统的研究蛋白质相互作用的方法如交联、免疫共沉淀、亲和层析等均是采用体外实验(invitro)进行的,它受到环境、实验条件等多种因素的影响。而酵母双杂交系统则是采用体内实验(invivo),不易受外界环境的影响,而且所有操作均在核酸水平上进行,不需要蛋白质的大量纯化就可以检测到蛋白间微弱的相互作用。但是该系统也存在一定的局限性。3.1重视细菌双杂交分析过程中的假阳性现象由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母内表达时的转录激活作用,使prey-BD融合基因与bait-AD融合基因表达产物无需特异结合就能启动转录系统。或者某些蛋白的表面有对其它蛋白的低亲和力区,易形成蛋白体复合物,也可引起报告基因的表达,使酵母出现相应表型,产生假阳性结果。所分析的可能存在相互作用的蛋白必须定位于核内,才能激活报告基因,但很多蛋白的相互作用依赖于翻译后加工,如二硫键的形成等要在胞浆内完成。因此有些蛋白就不能采用该方法。假阴性现象也是双杂交分析过程中经常碰到的问题。为此人们初步建立了哺乳动物双杂交系统作为酵母双杂交系统的辅助手段。另外还构建了SOS恢复系统和泛素专一性蛋白酶系统针对膜受体,细胞外分泌蛋白等方面进行研究。由于某些蛋白本身具有激活转录功能(如RNA聚合酶II转录激活因子)或在酵母中表达时发挥转录激活作用,使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域,能与其他蛋白形成稳定的复合物,从而引起报告基因的表达,产生“假阳性”的结果。为了解决这个问题,Marsolier等人提出了建立在RNA聚合酶III转录基础上的双杂交系统。James等人还构建了含三种不同的报告基因(ADE2,HIS3和LacZ)的酵母PJ69-4A菌株,这三种报告基因分别受三种不同的启动子(Gall,Ga12和Ga17)调控,而这三种不同的启动子都由GAL4激活,该菌株可灵敏地检测出很弱的结合作用,从而显著地消除假阳性。3.3酵母细胞的生长某些诱饵蛋白质或待筛选蛋白质在酵母中大量表达时,可能对酵母产生一定的毒性作用,如使酵母体内的信号传导通路阻断,干扰酵母中正常基因的表达调控,抑制酵母细胞的分裂,甚至使酵母细胞在选择性培养基上不能生长等,由此使得某些种类的蛋白质不能在该系统中进行分析。针对这些异源蛋白质对酵母生长的毒性作用,近年来在双杂交系统中的主要改进是选用更加灵敏的报告基因从而降低这些异源蛋白在酵母中的表达量,减轻这些异源蛋白质在酵母中的毒性,如采用LexA酵母双杂交系统,该系统中GAL4的BD区段被原核生物的LexA蛋白质编码区所取代,单纯疤疹病毒的88个VP编码区则取代了GAL4的AD区段。4灵敏度和特异性由于酵母双杂交系统仍存在着一定的缺陷与局限,基于酵母双杂交的基本原理,近年来,双杂交系统在被广泛应用中不断得到改进,产生了许多相关的研究方法与技术,其灵敏度和特异性也得到了显著提高。4.1酵母单杂交系统酵母单杂交系统(One-hybridsystem)最早是1993年由Li根据酵母双杂交技术的原理提出的,用于研究DNA-蛋白质之间的相互作用。单杂交系统与双杂交系统的区别在于前者把要研究的DNA序列置于报告基因上游,以这段特异性的DNA序列为诱饵,去筛选cDNA文库编码的靶蛋白,不需要BD-X的参与;而双杂交系统是用诱饵蛋白来筛选与之结合的蛋白。单杂交系统在细胞信号转导以及基因调控等功能研究中有重要作用。4.2逆向报告基因反向双杂交系统(Reversetwo-hybridsystem)最早是在1996年由Vidal等提出的。该系统采取反向筛选的方法,最大的特点就是将蛋白质之间的解离作用变为一种选择优势,其关键在于逆向报告基因的引入。常用的报告基因有3种,即URA3、CYH2和LYS2。当野生型BD2X与AD2Y间发生相互作用时,启动了毒性报告基因的表达,它对酵母菌株有毒性或者是致死的。当二者解离时毒性报告基因不能表达,菌株具有生长优势。在对蛋白质中有重要作用的功能域、作用位点以及影响蛋白质结合或解离因素的研究中,反向双杂交系统发挥了重要作用。4.3对系统的影响核外双杂交系统是构建在一个非转录基础上的双杂交系统,也叫SOS蛋白招募系统(SOSrecruitmentsystem)。它是把蛋白质相互作用的场所从核内转移到酵母的细胞膜上,通过应用两个蛋白质相互作用后对Ras信号通路的恢复作用而取代传统的转录激活机制,克服了传统双杂交系统的一些局限性。SOS蛋白招募系统的主要优点在于被研究蛋白质的相互作用是发生在细胞质而不是细胞核中,因此,其应用范围更加广泛,但同时也存在一些假阳性问题。4.4第3个分子融合系统三杂交系统(Three-hybridsystem)是Sen-Gupta于1996年发展起来的,其基本原理与双杂交系统基本相同,只是2个蛋白的相互作用需通过第3个分子的介导。这一系统的主要特征是两个融合蛋白在空间上的靠近需要第3个分子的参与,第3分子可以是蛋白质、激酶、多肽、DNA、RNA或小分子配体等。它们可通过修饰诱饵蛋白或靶蛋白使二者发生相互作用,或者诱导它们的构象发生改变从而产生相互作用,进而启动报告基因的表达。4.5蛋白质功能的实现—哺乳动物双杂交系统哺乳动物双杂交系统能够检测相互作用依赖于需经蛋白质翻译后修饰的蛋白质。酵母菌属于低等的真核生物,对蛋白质翻译后的加工修饰如糖基化、甲基化、磷酸化以及二硫键的形成等修饰水平很低。哺乳动物双杂交系统可克服酵母双杂交系统的不足,适用于对蛋白质功能的进一步研究,其原理和酵母双杂交系统相同,把编码诱饵蛋白和靶蛋白的基因克隆到相应的载体上,采用磷酸钙共沉淀转入Hela等哺乳动物细胞中,当饵蛋白和靶蛋白发生相互作用时,激活了报告基因,可通过报告基因的表达产物进行检测。哺乳动物双杂交系统已成功地验证了小鼠P53蛋白与SV40大T抗原之间以及FRAP与FKBP12两种蛋白之间的相互作