啤酒废弃酵母泥除杂脱苦工艺研究

啤酒废弃酵母泥除杂脱苦工艺研究

近年来的一些研究表明，梨糖酸及其庞大的不完全脱水产物，如肌苷酸（imp）、鸟苷酸（mp）、细胞苷酸（cmp）和尿苷酸（ump），在医药、食品、保健品、农业等行业发挥着重要作用。其中鸟苷酸(GMP)和肌苷酸(IMP)是强力助鲜剂,胞苷酸(CMP)和尿苷酸(UMP)可作为生产治疗癌症、肝炎及冠心病等药物的原料。在化妆品中加入核酸或其水解物,可促进皮肤蛋白合成,达到养护皮肤的作用。在农业上,RNA降解物具有促进作物生长增产的作用,已在水稻、小麦、柑橘及多种蔬菜生产中应用,取得了明显的增产效果。进一步研究表明核糖核酸具有维持机体免疫功能、抗氧化、提高机体蛋白质和铁的生物利用率、降低胆固醇和抗衰老等多种生理功能。因此,核糖核酸的开发研究越来越受到重视。啤酒废酵母是啤酒生产的副产物,每生产100吨啤酒大约有1~1.5吨啤酒废酵母产生。我国年产啤酒已超过2000万吨,每年啤酒废酵母的排放量达20~30万吨。啤酒废酵母营养价值相当丰富,它由约40%~50%蛋白质、6%~8%核酸、30%~50%碳水化合物、2.8%~3.0%脂质、5%~7%水分和6%~7%灰分组成,且氨基酸组成合理,并同时含有丰富的维生素和矿物质。因此,合理利用这一资源既减少环境污染,又可创造极其可观的经济效益。目前,从啤酒废酵母中提取核糖核酸的方法较多,包括盐法、稀碱法、机械法、氨法、自溶法、酶法等,其各自优缺点对比分析见表1。本实验以啤酒废弃酵母泥为研究对象,着重探讨了啤酒废弃酵母泥除杂、胶苦与其RNA提取技术参数,以期为啤酒生产企业解决废弃酵母泥污物提供一条切实可行的技术路线。1材料和方法1.1废弃酵母泥的制备全麦啤酒、辅料啤酒、黑麦啤酒、小麦啤酒4种废弃酵母泥均由金汉斯集团公司提供。DEPC试剂Sigma公司;碳酸氢钠、酒石酸、氯化钠、无水乙醇、盐酸等分析纯试剂北京化工厂。1.2日本hh-s试验J-6型多头磁力加热搅拌器江苏金坛荣华仪器制造有限公司;CR20B2型高速冷冻离心机日本日立公司;HH-S数显恒温水浴锅常州市国立试验设备研究所;ZD-2型自动电位滴定仪上海虹益仪器仪表有限公司;T6新悦-可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司。1.3啤酒废酵母酵母细胞废弃啤酒酵母泥的预处理与提取RNA的工艺流程如下:啤酒废酵母→酵母悬液→除杂→脱苦→离心→弃上清液→干净酵母细胞→配制酵母悬液→盐析→冷却→离心→乙醇沉淀并调pH值→过夜→离心→已醇洗涤→离心→RNA1.4rna纯度测定采用紫外分光光度法测定核糖核酸产品纯度,通过A260/A280的比值来检测其纯度。当比值在1.7~1.9之间时,RNA的纯度较好;若比值小于1.7,则表明蛋白杂质较多;若大于1.9,则表明RNA已经降解。1.5rna含量的测定采用紫外分光光度法测定核糖核酸含量。通过分光光度计测定RNA溶液在260nm处的吸收度并计算RNA的含量,要求分光光度计A260的读数介于0.15~1.0之间为可靠值。按公式(1)计算总RNA浓度。1.6r1提取率的计算4种啤酒废酵母中RNA提取率公式如下:1.7核酸rna高温盐析法提取核糖核酸是基于改变酵母细胞的渗透压,加热使细胞自身裂解而释放出核糖核酸。利用核酸溶于水和在等电点溶解度最小的性质,调节pH值,使其从溶液中沉淀下来,洗涤离心,收集粗品RNA。采用L16(45)正交试验设计考察酵母浓度A、NaCl浓度B、抽提温度C、抽提时间D四个主要因素对A260/A280(Y1)、核酸含量(Y2)、提取率(Y3)三指标的影响。2结果与分析2.1啤酒废酵母泥的除杂效果回收酵母泥含有麦芽壳,酒花沉淀、析出蛋白质沉淀等物质,提取RNA之前必须经过洗涤、除杂等工艺处理。不同的酵母悬液浓度和不同大小的筛目对啤酒废酵母泥的除杂有着不同的影响,尤其是酵母悬液浓度。当浓度大时,易成糊状,泡沫多,且难过筛,酵母损失大。经大量预实验,在过筛2次的前提下,以干净酵母泥的得率为考察指标,其结果如图1所示,80目除杂效果明显高于100目。因此,确定最佳除杂工艺为:酵母悬液浓度8%,过80目筛两次。2.2脱苦时间与脱苦剂的筛选啤酒酿制过程中,添加的啤酒酒花及其代谢产物吸附在酵母细胞表面使其呈现淡咖啡色,并带有苦味与令人不愉快的酵母味。因此提取RNA前必须经脱苦处理,使酵母颜色由深褐色变为白色,以保证对后续提取物质不产生副作用。啤酒废酵母泥的苦味是由酒花中的α-酸所导致,经脱苦离心后,得到废酵母泥沉淀,测上清液中的电导率。电导率越大,说明α-酸含量越多,即吸附在废酵母泥表面的酒花及其代谢产物越少,脱苦效果越好。以经脱苦后的电导率(ms/cm)和pH值为考察指标,拟筛选脱苦时间与脱苦剂的条件,结果如图2所示。图2可知,酒石酸的脱苦效果好于碳酸氢钠。随着脱苦时间的延长,酵母悬液的电导率加大,说明随着时间的延长,脱苦效果越明显。但是,当脱苦时间达到30min后,脱苦时间对酵母悬液电导率的影响已经不太显著。因此,本着增加电导率并且节省时间两方面考虑,选择5%酒石酸脱苦30min。2.3不同原料的啤酒废酵母脱苦效果利用2.1和2.2确定的最佳工艺分别对四种啤酒废酵母进行了除杂、脱苦,其对比分析结果如图3所示。图3可知,四种来源啤酒废酵母的脱苦程度顺序依次为:辅料>黑麦>小麦>全麦。比较四种干净啤酒废酵母泥得率大小依次为:小麦>全麦>黑麦>辅料。2.4最佳提取工艺的确定采用L16(45)正交试验设计,极差分析结果如表2所示。由表2中的A260/A280极差分析结果可知,考察因素的主次顺序如下:D(抽提时间)>A×B>B(NaCl浓度)>C(抽提温度)>A(酵母浓度)。由表3选择A×B交互作用最优组合为A2B1,故获得高纯度RNA的最佳提取工艺为:A2B1C3D4,即提取时间3h,提取温度95℃,酵母浓度6%,NaCl浓度6%。由表2中的核酸含量极差分析结果可知,考察因素的主次顺序如下:D(抽提时间)>A×B>C(抽提温度)>A(酵母浓度)>B(NaCl浓度),由表3选择A×B交互作用最优组合为A4B3,故获得高含量RNA的最佳提取工艺为:A4B3C4D4,即提取时间5h,提取温度100℃,酵母浓度10%,NaCl浓度10%。由于实验是期望优化获得核糖核酸提取率较高的工艺技术参数,故由表2中的核酸提取率极差分析结果可知考察因素的主次顺序如下:D(抽提时间)>C(抽提温度)>A×B>A(酵母浓度)>B(NaCl浓度),并由表3选择A×B交互作用最优组合为A1B4,故获得高RNA提取率的最佳提取工艺为:A1B4C4D4,即提取时间5h,提取温度100℃,酵母浓度4%,NaCl浓度12%,为L16(45)正交试验方案中的第四组实验,A260/A280值为1.62,核酸含量为8.46mg/ml,核酸提取率为13.8%。3结论3.1啤酒酵母泥提取率当采用8%的酵母悬液浓度,过80目筛两次除杂,5%酒石酸脱苦30min时,可获