生物制品生产技术-疫苗生产的基本程序

细菌毒素指致病性细菌产生的毒性物质，分为外毒素和内毒素两类。

外毒素是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质，主要是由革兰氏阳性细菌产生。外毒素属蛋白质，一般容易灭活，可用甲醛脱毒而成为类毒素。细菌毒素的概念

某些细菌外毒素可用甲醛等处理后脱毒的制品，毒性虽消失，但免疫原性不变，故仍然具有刺激人体产生抗毒素，以起到机体从此对某疾病具有自动免疫的作用。常用的甲醛溶液的浓度是0.3~0.4%,它可使细菌外毒素的电荷发生改变，封闭其自由氨基，产生甲烯化合物。作用机理

某些细菌外毒素可用甲醛等处理后脱毒的制品，毒性虽消失，但免疫原性不变，故仍然具有刺激人体产生抗毒素，以起到机体从此对某疾病具有自动免疫的作用。它们广泛地应用于预防某些传染病。如向人体注射白喉类毒素后可以预防白喉。作用机理

若在类毒素中加入适量的磷酸铝或氢氧化铝，即成吸附精制类毒素。此类制剂在体内吸收较慢，能较长时间刺激机体，使机体产生高滴度抗体，增强免疫效果。类毒素也可与死疫苗混合制成联合疫苗。如百白破三联疫苗，就是由百日咳死菌苗、白喉类毒素、破伤风类毒素混合制成的。作用机理

制备出高纯度的精制破伤风类毒素的均为一一蛋白质。从理论上来讲，各种蛋白分离纯化的技术都可用于提纯素素或类毒素。但是考虑到残余物、规模生产等要素，目前认为硫酸饺二段沉淀加透析或超滤的方法是最适合于大规模生产的简易可行的方法。改进精制方法

目前，铝剂对大脑神经组织的毒性作用日益受到重视，这种新型破类的研制具有很深远的意义。近年来，已成功研制出这种新型的破类，初步应用于马匹免疫取得很大成功，并且对这种新型破类的一些理化和生物学特性进行了研究。改进类毒化的工艺改进类毒化的工艺国外曾报道用改进的新工艺制备——新型破伤风类毒素获得成功。此种类毒素的类毒化是完全的，且是不可逆的，其免疫原性并不能因磷酸钙的吸附而增强。此种类毒素作为液体疫苗和传统的吸附精制破伤风类毒素有同样的免疫原性。温度:一般脱毒采用37～39℃。pH:在微酸性时脱毒速度慢；在碱性时脱毒速度快，但类毒素抗原性易受破坏。甲醛含量:<1%。

脱毒物理学方法：冻干、氧化铝吸附剂化学沉淀法：酸、盐析、有机溶剂层析法：凝胶过滤类毒素的精制

疫苗（vaccines）

根据我国农业部文件规定：“由特定细菌、病毒、立克次氏体、螺旋体、支原体等微生物及寄生虫制成的主动免疫制品，一律称为疫苗”。

1.活疫苗

活疫苗是指抗原物质可在体内繁殖，能刺激机体产生系统的免疫应答和局部免疫应答的疫苗。活疫苗特点：能够刺激机体产生体液免疫和细胞免疫；免疫力持久；有利于清除局部病毒；产量高、生产成本低。

缺点：活疫苗残毒动物群体内持续传代后，有毒力增强和反祖的危险；可以出现不同抗原的干扰现象。(1)弱毒疫苗

弱毒疫苗是由微生物自然强毒通过物理、化学或生物处理，并经连续传代和筛选培养而成的，丧失或减弱了对宿主动物致病力，但仍然保存良好免疫原性和遗传特性的毒株；或从自然界筛选、具有良好免疫原性的自然弱毒株，经培养后制备的活疫苗。

弱毒疫苗又可分为同源疫苗和异源疫苗。同源疫苗(homologousvaccines)：用所制备疫苗的菌株或毒株来自于预防传染病的本动物，这种疫苗又称为同种疫苗。

异源疫苗(heterogenousvaccine)：利用具有类属性保护性抗原非同种微生物所制成的疫苗，称为异源疫苗。弱毒疫苗(2)重组活疫苗

这种疫苗菌(毒)株基因变化一般不是点突变，故其毒力较为稳定，反祖机率小，如伪狂犬病基因缺失疫苗。(3)基因工程活载体苗

此类疫苗不仅具有活疫苗和死疫苗的有点，而且对载体病毒或细菌以及插入基因相关病原体的感染均有保护力。同时，一个载体可以表达多个保护抗原基因，可获得具有多价或多联特性的疫苗。2.死疫苗

死疫苗特点：抗原不能在动物体内繁殖；比较安全，不发生全身毒性作用；无毒力反祖现象；有利于制备多价或多联疫苗；制品稳定受外界环境影响少。缺点：此类疫苗免疫剂量大，生产成本高，需多次免疫，故常需要用佐剂或携带载体系统来增强免疫效果，一般只能诱导机体产生体液免疫效应。(1)灭活疫苗

灭活疫苗，又称死苗

制造灭活苗菌(毒)种通常是标准强毒或免疫原性优良的弱毒株。菌(毒)株经人工大量培养后，用理化方法将其杀死(灭活)后制成的疫苗，即灭活疫苗。（一般灭活苗）

自家灭活苗：此种疫苗可用以治疗慢性的、反复发作而用抗生素治疗无效的细菌性感染或病毒性感染，如顽固性葡萄球菌感染症、小儿顽固性哮喘。这是一种严格限制的灭活苗，必须小计量反复注射，决不可施于另一同样的患者。

灭活疫苗灭活疫苗

脏器或组织灭活苗：利用病、死动物的含病原微生物脏器制成乳剂，加甲醛等灭活脱毒所制成的疫苗。(2)类毒素

细菌外毒素，用适当浓度(0.3%-0.4%)甲醛溶液处理，使之脱毒而制成的生物制品，称为类毒素(toxoid)。细菌外毒素为蛋白质，兼有毒性及抗原性，能刺激机体产生特异性的中和其本身的抗体——抗毒素。外毒素经甲醛溶液脱毒后失去毒性，但保留较强的免疫原性成为类毒素，类毒素比毒素更稳定。(3)亚单位苗依照“取其精华，去其糟粕”的原则，撇弃生物体中具有毒副作用的成分，而只吸纳其中的病原部分制造而成的。亚单位苗可免除出全菌体和全病毒疫苗的一些副作用，保证了疫苗的安全性，但制造成本较高，通常免疫保护效果低于全菌体和全病毒疫苗。

(4)基因工程亚单位苗

利用基因工程技术，取出微生物中编码保护性抗原肽段的基因，再将此基因与质粒等载体重组，导入受体菌(细菌、酵母)或细胞，使之在受体菌或细胞内高效表达，产生大量保护性肽段，提取此保护性肽段，加佐剂后制成的疫苗，即基因工程亚单位苗。

转化蛋白表达定性分析

E.coliIPTG诱导WesternblotSDS蛋白纯化获得单一蛋白奠定研究基础诱导免疫制备抗体保护性抗原基因DH10筛选重组子提取重组Bacmid转座转染LacZKanGm表达及检测TranscriptionTermination(TT)MCSBglⅡPichiaExpressionvectorforiHISAmprBglⅡ3´AOXBglⅡBglⅡ重组质粒构建线性化电转化重组子筛选表达与检测TTGneofinterestHIS43’AOX1Geneofinterest5’PAOX1HIS43’AOX15’AOX

AOX1ORF3’AOX1TTTT5’PAOX1Geneofinterest5’PAOX1HIS43’AOX1TTBglⅡBglⅡPichiaGenomePichiaGenome3.基因疫苗基因疫苗又称核酸疫苗，包括DNA疫苗和RNA疫苗基因疫苗的特点：疫苗本身不能在机体增值，但可被细胞吸收，并在细胞内指导合成抗原。合成的抗原不仅可以诱导机体产生保护性抗体，还可以激发细胞免疫应答，尤其是细胞毒性T淋巴细胞反应。

细菌性灭活疫苗制造细菌性活疫苗制造病毒性动物组织疫苗制造

病毒性禽胚培养疫苗制造疫苗制造

细菌性灭活疫苗制造

接种培养基浓缩佐剂菌种种子液菌液

菌苗原液灭活菌液配苗、乳化分装检验

冻干接种培养基

保护剂弱毒菌种种子液菌液菌苗原液配苗检验活疫苗

细菌性活疫苗制造

佐剂种毒健康动物感染动物毒液保护剂分装冻干活疫苗灭活病毒液乳化分装灭活苗病毒性动物组织疫苗制造

注意事项:

动物选择种毒常用的接种途径观察与收获制苗脑内注射静脉注射肌肉注射皮下注射腹腔注射离心佐剂种毒鸡胚收获尿囊液浓缩病毒配苗分装检验病毒性禽胚培养疫苗制造

适应于鸡胚的种毒包括自然弱毒与人工培育的弱毒两类。多为冻干毒。冻干毒种需按规定要求在鸡胚继代复壮，通常继代3代以上，经检定符合标准后方可作为生产疫苗的毒种,包括无菌检测、毒价和其他项目的检定等。种毒与毒种继代

受精卵必须来自SPF鸡群,从受精卵入孵开始至培育全过程都应保持无菌，要求一定的温度和湿度，且需不断翻动。

5～8日龄胚适用于卵黄囊接种：9－11日龄胚用于尿囊腔接种；10～12日龄胚适于羊膜腔接种；11～13日龄胚用于绒毛尿囊膜接种。（SPF：无特定病原菌）鸡胚选择

尿囊腔：流感病毒卵黄囊接种：乙型脑膜炎病毒绒毛尿囊膜：疱疹病毒。羊膜腔接种：流行性感冒病毒、流行性腮腺炎病毒鸡胚培养法【目的】了解用鸡胚分离、培养病毒的基本方法。【原理】鸡胚培养法是常用的病毒培养法之一，操作简便，来源容易，本身带病毒的情况也极为少见，一般选用白色壳薄的受精卵，主要用4种途径接种不同部位，即绒毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔及卵黄囊等。多数病毒都可以在鸡胚的不同部位增殖。【材料】1、鸡受精卵、蛋架、检卵灯、磨蛋机、透明胶纸。2、灭菌的手术刀、镊子、剪刀、平皿、1m1注射器及6号针头、12号针头。3、乙型脑炎病毒液、单纯疱疹病毒悬液、流感病毒稀释液

病毒接种途径1、尿囊腔接种法：（1）取10—11天龄鸡胚，在检卵灯下画出气室界限，于胚胎附近大血管处作好标记；消毒后，用灭菌刀尖打一小孔；用灭菌注射器吸取流感病毒悬液0.2m1，刺入0.5cm后，进行注射；以透明胶纸封闭注射孔，蜡笔做好标记。（2）置35℃孵箱中孵育，每日进行检视鸡胚的死活。如果鸡胚在接种后24h内死亡者，为非特异性死亡，弃之。（3）孵育3天后取出，放入4℃冰箱过夜。（4）次日取出鸡胚，消毒气室部分卵壳，用无菌剪刀去卵壳，用小镊子撕去卵膜。以无菌毛细吸管吸取尿囊液放于无菌试管中。2、卵黄囊接种法（1）取6～8天鸡胚，检卵灯下画出胎位和气室，垂直放于蛋架上，气室端向上。碘酒消毒气室中央，刀尖锥一小孔。（2）以1ml注射器及12号针头吸取乙型脑炎病毒液0.5ml，自小孔穿入垂直接种于卵黄囊内，深度为3cm左右，注入标本0.2ml～0.5m1，退出注射器。胶纸封口，37℃孵育。每天检卵并翻动2次。（3）取孵育24h以上濒死的鸡胚，于气室端开口，用镊子提起卵黄蒂，挤去卵黄液，用无菌生理盐水洗去卵黄囊上的卵黄液后将卵黄囊置于无菌平皿内，低温保存备用。3、绒毛尿囊膜接种法

（1）取12天龄鸡胚，检卵灯下标记胎位，于附近无大血管处碘酒消毒。用小锯片在其鸡胚旁无大血管处的卵壳上锯一四方形（勿伤壳膜），同时于气室用刀尖锥一小孔。（2）打开四边形之卵壳，勿伤及卵壳膜，滴加灭菌生理盐水一滴于壳膜上。用橡皮乳头从气室小孔吸气，可见盐水被吸下，绒毛膜下沉，形成人工气室。（3）用注射器吸取0.2ml～0.5ml单纯疱疹病毒液滴于绒毛尿囊膜上，胶纸封口。37℃孵育4～5天后收获。（4）收获：剪开气室，如接种效果成功，绒毛尿囊膜上可见明显疹斑。用无菌剪刀剪下此膜，置于无菌平皿内低温保存，备用。4、羊膜腔接种法（1）取12天鸡胚，经照视后划出