紫甘薯花色苷色素抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和啤酒酵母作用的研究

紫甘薯花色苷色素抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和啤酒酵母作用的研究

紫甘薯是旋花科的一种一级植物，具有紫色的根系和肉质。紫甘薯花色苷的主要成分是矢车菊色素和芍药色素,且具有抗氧化和保健功能。花色苷作为抑菌物质使用有不产生耐药性、不会导致环境的污染等特点。目前关于花色苷的抑菌功能报道较少,程翠林等和岳静等分别用牛津杯法初步探讨了大花魁花色苷抑菌作用和紫甘薯红色素体外抑菌性,但关于花色苷的抑菌作用机制尚未研究。本文研究了紫甘薯花色苷抑菌谱及对致病菌抑制作用机理等,旨在为开发花色苷新的功能特性提供理论依据。1材料和方法1.1材料表面1.1.1验材料及材料选用新鲜、无病虫害、无霉烂的紫甘薯块根作实验材料,品种为“川山紫”,由徐州甘薯研究所提供。紫甘薯清洗后切成5mm～8mm薄片,50℃条件下烘干粉碎过100目筛后备用。1.1.2离心条件下离心紫甘薯粉用酸化乙醇溶液(95%乙醇∶1mol/L盐酸=9∶1,V/V)提取3h,于10000r/min下离心20min,取上清液。用石油醚脱脂(浸提液∶石油醚=1∶2),减压浓缩后再上AB-8大孔树脂柱用酸化水(0.01%HCl)除去多糖等水溶性杂质,用0.01%HCl乙醇为洗脱剂洗脱花色苷,所得溶液减压浓缩(40℃)得紫甘薯色素浓缩液(花色苷含量为189.62mg/L)。1.1.3南京中药常见的病原菌大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staph.aureus)、黑曲霉(Asp.niger)和啤酒酵母(Sacc.cerevisiae),由南京中医药大学病原与免疫学实验室提供。1.2实验方法1.2.1统一培养基的制备在培养皿中倾倒20mL培养基,待培养基冷却后,将0.10mL菌液(105CFU/mL)均匀涂布于培养基上,灭菌的牛津杯置于培养皿中。再将0.05mL花色苷溶液加入牛津杯中,同时设空白对照。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌置于恒温培养箱中37℃培养72h,啤酒酵母、霉菌置于恒温培养箱中28℃培养36h。1.2.2紫甘薯花色苷的抑菌效果测定取紫甘薯花色苷用一定量灭菌水溶解后采用二倍稀释法加入培养基中,然后将稀释后的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉和酵母(105CFU/mL)接种于各试管中,分别于37℃和28℃培养箱内恒温培养24h后,以完全无菌生长的最高稀释度的最低抑菌浓度(MIC)考察紫甘薯花色苷的抑菌作用。1.2.3细菌可溶性蛋白的测定大肠杆菌培养至对数生长期时,按5%接种量分别接种于100mLLB液体培养基(培养基配方为：牛肉膏0.5%,蛋白胨1%,NaCl0.5%,pH7.2)中,于37℃150r/min培养,分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、36h、48h取样,测样品OD640值,绘制花色苷作用后的E.coli生长曲线。分组情况如下：CK：对照组,于培养的同时加入1mL无菌水,A组和B组：于培养的同时加入花色苷使其终浓度为1/2MIC、1MIC;C组和D组：于培养4h后加入花色苷分别使其终浓度为1/2MIC、1MIC;E组和F组：于培养8h后加入花色苷分别使其终浓度为1/2MIC、1MIC。菌体蛋白SDS电泳分析：大肠杆菌培养至对数生长期时,按5%接种量分别接种于100mLLB液体培养基中,分为对照组和处理组,对照组加入1mL无菌水、实验组加入花色苷使其终浓度为1MIC,继续于37℃、110r/min培养,分别于4h、8h取样,稀释成相同吸光值取样25mL于5000r/min离心10min,然后用生理盐水洗涤2次,加入上样缓冲液100µL,沸水浴5min～10min,5000r/min离心10min,取上清进行SDS凝胶电泳。结果利用凝胶成像系统定量分析E.coli胞内可溶性蛋白含量的变化。实验所选用浓缩胶浓度为5.0%,分离胶浓度为12%的SDS凝胶系统,染色液为0.1%的考马斯亮兰。透射电子显微镜观察实验：按电镜样品制备及超薄切片技术操作,用吸管沿管壁缓慢加入0.3%戊二醛固定液,4℃静置15min～30min。再用10000r/min～13000r/min离心10min,弃去上清液。用吸管沿管壁缓慢加入3%戊二醛,再用1%四氧化锇固定,丙酮逐级脱水,Epon812树脂包埋,超薄切片,醋酸铀及枸橼酸铅双重染色,H2600型透射电镜观察。2结果与分析2.1对啤酒酵母和黑曲霉的抑制作用由图1和表1可知,紫甘薯花色苷对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用,而对啤酒酵母和黑曲霉无抑制作用。并且,花色苷存在时,黑曲霉反而生长状况良好,表明花色苷不但不能抑制霉菌而且对霉菌生长还有一定促进作用,这可能因为霉菌具有分解糖苷键的酶,使紫甘薯花色苷的糖苷分解,并作为碳源使用。2.2lngp酶抑制试验紫甘薯花色苷最小抑菌浓度实验结果(表2)表明,紫甘薯花色苷对细菌的抑制效果明显,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑制浓度分别为800µg/mL和200µg/mL。但对霉菌和酵母菌无抑制效果。大肠杆菌与金黄色葡萄球菌分属革兰氏阴性菌和阳性菌,说明紫甘薯花色苷对细菌有广泛的抑制作用。2.3对大肠杆菌生长和抑菌效果的影响紫甘薯花色苷对大肠杆菌生长的影响见图2。由生长曲线可以看出,对照组随着培养时间的延长其菌体浓度逐渐增加,实验组在接入菌体的同时加入紫甘薯花色苷可以较好地抑制大肠杆菌的生长。随着花色苷加入时间的延迟其抗菌效果越显著,并在短时间内使其菌体浓度下降到较低水平,抑菌效果随着花色苷浓度的增加变得更加明显,但在对数生长期末期及稳定生长初期,花色苷对菌体抑菌作用开始变弱,并且出现杀菌起效时间的延迟。紫甘薯花色苷可能主要抑制了E.coli对数生长期的菌体分裂。随着花色苷作用时间的延长,花色苷抑菌作用变弱,菌体浓度有所回升,可能是部分花色苷在碱性的LB培养基环境中被破坏而失去抑菌作用。2.4浓度对花色苷抑菌率的影响由图3可知,花色苷的抑菌率均随作用时间的延长呈先迅速上升然后缓慢下降的趋势。随着菌体浓度的升高,花色苷在相同的作用时间内抑菌率减小;在相同的菌体浓度条件下,抑菌效果随着花色苷浓度的增加而升高,并且在菌体对数生长期杀菌率变化较大,可能是对数生长期的大肠杆菌对花色苷较为敏感,这是否和菌体的生长代谢过程或者某些物质的合成有关需要进一步研究。2.5紫甘薯花色苷的质壁分离由透射电镜图(图4)可以看出,对照组E.coli菌体呈棒状,细胞壁完整、边缘清晰、平整、无缺陷,无裂痕,无质壁分离现象,细胞质、核致密均匀。经紫甘薯花色苷作用4h后的处理组则可以明显的看到菌体变形,细胞质稀薄,出现明显的质壁分离。随其作用时间延长,出现第二种状态,细胞质解体,形成小空泡,并连接成大空泡,成为空腔,细胞死亡。2.6对大肠杆菌蛋白表达的影响由大肠杆菌SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱(图5)可以看出,花色苷对大肠杆菌蛋白表达没有明显影响,未见特征性条带的消失。凝胶成像系统定量分析表明,仅在60kD附近的蛋白质合成量有影响。这表明花色苷可以抑制菌体细胞内某种蛋白质的合成。3花色苷抑菌作用紫甘薯花色苷加入菌液后,短时间抑制大肠杆菌作用较明显。但随着作用时间的延长,抑菌作用逐渐减弱。随着溶液pH进一步升高,醌型碱可逆转变为假碱与查耳酮,此时花色苷的溶液呈无色。LB培养基pH在7.0左右,花色苷刚加入以二苯基苯丙吡喃阳离子形式存在,此时抑菌活性最强;随着加入时间延长花色苷互逆转变成其它三种形式,抑菌作用减弱。表明二苯基苯丙吡喃阳离子形式花色苷抑菌活力最强。同时生长曲线中观察到花色苷作用主要发生在对数生长期。经花色苷作用后,E.coli和Staph.aureus菌体出现质壁分离,细胞质稀薄,菌体解体成空泡、菌体细胞溶解死亡,这表明花色苷能够影响细胞壁的通透性。黄卫文等对中药抑菌研究中曾报道,皂甙类化合物与细胞蛋白结合成复合物的作用。花色苷属苷类物质可能有同样的作用机理。SDS分析表明,花色苷作用菌体后部分蛋白的谱带的量明显减少,