质粒构建总结

#附件三:编号:华中科技大学国家级大学生创新创业训练计划项目申请表项目名称：跨膜型肿瘤坏死因子与TRAF1结合位点的研究所属一级学科：免疫项目负责人：赵吉辉专 业 ：临床医学八年制院 系 ：基础医学院申请资助经费：11000实施起止时间：2011年9月20日至2012年9月1日填表时间：2012年4月5日华中科技大学教务处编制

、项目组成员基本信息申请人或团队姓名学号入学时间所在院（系）、专业联系电话E-mail赵吉辉U2008170122008基础医学院临床医学八年制13297042581247100371@QQ.com卿湘城U2008170562008基础医学院临床医学八年制15072438503353220817@QQ.com孙洁U2009105172009基础医学院临床医学八年制152718194731274778693@QQ.com聂佳丽U2009105292009基础医学院临床医学八年制152718124961076090471@QQ.com团队名称：指导教师姓名李卓娅年龄61工作单位华中科技大学冋济医学院职称教授、博导职务中国免疫学会基础免疫学专业委员会委员|E-mailzhuoyalitj@163.com研究方向分子免疫、肿瘤免疫、感染免疫联系电项目创新及特色项目创新特色概述（限50字）本研究首次鉴定tmTNF-a胞浆段结合TRAF1的位点，该研究进一步探讨tmTNF-a反向信号分子之间的相互作用基础，为干预tmTNF-a反向信号诱导肿瘤抵抗凋亡提供新的线索和分子靶占八、、三、项目综述（前期预研基础、自身具备的知识条件、项目实施的科学性、创新性及技术可行性等）我们是来自临床医学八年制08级的学生卿湘城，赵吉辉以及来自临床医学八年制 09级的孙洁、聂佳丽。我们是整合按系统教学，目前已经学习了医学概论，包括生物化学，系统解剖学，病理学，医学免疫学，病理生理学，生理学，药理学，组织胚胎学，医学遗传学的概论，以及消化系统，呼吸系统，泌尿生殖系统系统，心血管系统等基础知识，并学习过免疫组化 、分子生物学、机能学、实验动物学等实验操作。通过对文献检索的学习，我们也知道如何利用图书馆给予我们的巨大财富去查找有关资料，追踪医学科学研究的线索和热点，及时更新我们的医学知识，紧跟医学的前沿。通过将近一年的医学知识学习，让我们更加热爱这门神圣的学科，并在学习过程中发现不少自己感兴趣的问题，同时也使我们具备了一定基础知识去利用医学实验研究探索自己感兴趣的问题。我们两个均对免疫与肿瘤及其研究具有浓厚的兴趣，所以我们选择了本研究方向。并且我们已经对本课题的相关资料作了详实的查阅，平时积极利用课余时间去实验室观摩师兄师姐在实验室的操作，对实验室的运作流程，注意事项有了一定认识，通过认真的阅读文献和思考问题，并及时和导师交流，我们对本课题在国内外的研究现状、水平和发展趋势有了比较深刻的了解。这次学校开展的基础科研实验给我们提供了一个非常好的平台，这样一个给予大学生难得的锻炼机会，使我们可以真正地接触到科学的前沿，深入到医学科研的实际操作中去。希望能够通过这次实验研究，锻炼我们的科学思维与能力，培养和提高自己的科学创新能力，为我们今后的临床医学实践打下扎实的基础，我们也定会获益匪浅。我们将尽全力做好这次科研，恳请审核批准。项目科学性肿瘤坏死因子-a(tumornecrosisfactor-a,TNFa)是具有免疫调节和抗肿瘤作用等多种生物学效应细胞因子，是目前肿瘤生物治疗中研究最为活跃的细胞因子之一，其在体内以 17kD的分泌型(secretedTNF-a,sTNF-a)和26kD的跨膜型(transmembraneTNF-atmTNF-a)形式存在⑴。在研究tmTNF-a过程中发现：肿瘤细胞高表达tmTNF-a可通过其反向信号通路导致NF-kB组成性活化，上调抗凋亡基因，促进肿瘤细胞的存活 [2]，并保护它们抵抗促凋亡因素的影响[3]。TNF课题组在前期研究工作中，应用免疫共沉淀首次发现 TRAF1可与tmTNF-a胞浆段结合，作为接头分子募集其它信号分子，形成tmTNF-a信号复合物，启动反向信号，活化NF-kiB,从而保护肿瘤细胞抵抗凋亡⑷。前期研究还证实[4]tmTNF-a胞内段无论缺失CKI磷酸化位点(-75〜-69)，或缺失川型PDZ结合基序(-68〜-62)，都会影响TRAF1与tmTNF-a胞浆段结合。但是，上述哪个结构域直接与TRAF1结合，其结合基序是什么，仍然不清楚。本项目主要鉴定tmTNF-a胞浆段与TRAF1结合的基序，从而进一步探讨tmTNF-a反向信号分子之间的相互作用基础，为选择性阻断反向信号，充分发挥tmTNF-a正向信号的杀瘤作用提供新的策略与靶点。参考文献Black,R.A.,C.T.Rauch,C.J.Kozlosky,J.J.Peschon,J.L.Slack,M.F.Wolfson,B.J.Castner,K.L.Stocking,P.Reddy,S.Srinivasan,N.Nelson,N.Boiani,K.A.Schooley,M.Gerhart,R.Davis,J.N.Fitzner,R.S.Johnson,R.J.Paxton,C.J.March,andD.P.Cerretti.1997.Ametalloproteinasedisintegrinthatreleasestumour-necrosisfactor-alphafromcells.Nature385:729-733.YanD,QinN,ZhangH,LiuT,YuM,JiangX,FengW,WangJ,YinB,ZhangT,ZhouM,LiZ(2009);ExpressionofTNF-alphaleadersequeneerendersMCF-7tumorcellsresistanttothecytotoxicityofsolubleTNF-alpha.BreastCancerResTreat.116(1):91-102.RRieger,DWhitacre,MJCantwell1,CPrussakandTJKipps.Chimericformoftumornecrosisfactor-ahasenhancedsurfaceexpressionandantitumoractivitCancerGeneTherapy严丹.2010.跨膜型TNF-a反向信号通路及其保护肿瘤抵抗凋亡的分子机制 .华中科技大学博士论文60-76技术可行性所在免疫系课题组第二实验室已建立了一系列 tmTNF-a的实验模型，项目组成员将在免疫系的科研学习过程中熟练掌握本项目实施所需的核心技术，为本项目实验方案的顺利实施奠定了良好的基础。项目组研究成员较固定，且团队协作精神好，所在免疫系具备完成本项目的技术能力。此外，免疫系实验室和学校平台具备本项目所需的主要仪器设备。本项目的特色与创新之处本研究首次鉴定tmTNF-a胞浆段结合TRAF1的位点，该研究进一步探讨tmTNF-a反向信号分子之间的相互作用基础，为干预 tmTNF-a反向信号诱导肿瘤抵抗凋亡提供新的线索和分子靶点。四、项目实施方案项目方案（进程安排、成员分工等）实施步骤计划一、 TNF胞浆段不同片段对TRAF1的结合用PCR扩增TNF胞浆段的不同片段：-75~-69、-68~-62和-75~-62片段，将其分别连接至pET28a上，进行原核表达，并用Ni柱纯化。用His抗体包裹的磁珠分别与上述片段结合，洗去未结合分子；再与表达TRAF1（不带有His-tag）细菌裂解物和高表达TRAF1的Raji细胞裂解液进行Pulldown，洗去未结合分子。用WesternBlot观察哪个片段能与TRAF1结合。二、 鉴定TRAF1结合基序通过（一）实验结果，确认哪个片段可直接与 TRAF1结合，再对该片段分别设计5个不同氨基酸突变，直接合成带有His标签的短肽；分别用这些短肽与His抗体包被的磁珠结合，再与高表达TRAF1的Raji细胞裂解液进行Pull

down,用WesternBlot观察不同短肽与TRAF1的结合；3.分析上述结果，确定tmTNF-a胞浆段与TRAF1的结合基序，并合成该序列，再用Pulldown验证。具体工作是大家共同负责，合理安排彼此的时间进行。五、项目预期成果预期成果确认tmTNF-a胞浆段与TRAF1的结合基序，为干预tmTNF-a反向信号诱导肿瘤抵抗凋亡提供了新的线索和分子靶点。六、经费预算项目经费预算1