抗坏血酸谷胱甘肽测定

还原型谷胱苷肽GSH试剂配制（1）1mMGSH原则液10mL（现用现配）：称3.0733mgGSH,加蒸馏水至10mL。(不要)（2）5％磺基水杨酸500mL：25g溶于500mL水中。（3）6mMDTNB：称取0.118905gDTNB溶于50mLPBS（0.1M，pH7.5）中。（4）2mMNADPH：18.1mgNADPH溶于10mLPBS中。（5）1mMGSSG原则液10mL：6.126mgGSSG加PBS至10mL。(不要)实际配备0.1MPBS(pH7.5):3个解决*2个品种*3次重复*0.5ml*3次测定=27ml;（实际配备50ml）6mMDTNB:3个解决*2个品种*3次重复*0.2ml*3次测定=10.8ml;（实际配备50ml，实际用量0.1189g）2mMNADPH:3个解决*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml;（实际配备50ml,实际用量18.1mg）(1U)GRⅢ:3个解决*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml;（实际配备50ml,实际用量10ml）5％磺基水杨酸：3个解决*2个品种*3次重复*0.01ml*3次测定=0.54ml;（实际配备10ml）(实际用量0.5g/10ml)0.5mMPBS:3个解决*2个品种*3次重复*1.5ml*3次测定=81ml;（实际配备100ml）乙醚（二乙醚）:3个解决*2个品种*3次重复*10ml*3次测定=540ml;（实际配备1000ml）PBSBuffer0.5mM:3个解决*2个品种*3次重复*1.5ml*3次测定=81ml;（实际配备150ml）2-乙烯吡啶:3个解决*2个品种*3次重复*0.2ml*3次测定=10.8ml;（实际用量20ml）乙醚:3个解决*2个品种*3次重复*10ml*3次测定=540ml;（实际用量1000ml）1．标线制作：配制浓度为0，0.02mM,0.04mM,0.06mM,0.08mM,0.1mM,0.12mM的原则GSH溶液（吸取上述原则液各0.1mL）加入0.5mL0.1M磷酸钠Buffer（pH7.5）(含5mMEDTA)，0.2mL6mMDTNB,0.1mL2mMNADPH,0.1mL(1U)GRⅢ（谷胱甘肽还原酶）(sigma),从0.1mLGSH启动反映，测定650s的A412（OD412），绘制原则曲线。以PBS替代DTNB作空白。GSH（还原型谷胱甘肽）及GSSH（氧化型谷胱甘肽）（1）取1g新鲜叶片，加入10µL（能够取0.2g鲜样，加1.6ml提取液）5％磺基水杨酸，研磨后在14000g离心10分钟，取1mL上清液，加入1.5mL,0.5mMPBS（pH7.5）中，再用5mL乙醚（二乙醚）抽取二次（杂质会融到乙醚层中，而乙醚处在整个反映体系得上层，你直接用枪吸取上层乙醚丢弃即可，重复进行两次即为抽取两次），此提取液用于分析总谷胱苷肽含量。各取1mL上清液，加入1.5mLPBSBuffer0.5mM(pH7.5),0.2mL2-乙烯吡啶（原装试剂浓度）混合至乳胶状，在25℃反映1小时，再用5mL乙醚（原装试剂浓度）抽提2次，此提取液用于分析GSSG『GSSG－氧化型谷胱甘肽，GSH－还原型谷胱甘肽不能够直接测出，需测出氧化型和还原型谷胱甘肽含量，即总的谷胱甘肽含量，然后减去氧化型谷胱甘肽(GSSG）含量得到还原型谷胱甘肽含量（GSH））取反映混合液（0.5mL0.1MPBS(pH7.5)(内含5mMEDTA)，0.2mL6mMDTNB，0.1mL2mMNADPH,0.1mL(1U)GRⅢ（sigma），由加入0.1ml提取液开始反映，测OD412，在25℃下，反映650s（大概十分钟），分别计算总谷胱苷肽及GSH含量。以不加DTNB，加对应剂量的PBS作空白。还原型谷胱甘肽含量的测定办法（分光光度计法）实验试剂50g/L三氯乙酸（TCA）溶液（含5mmol/LNa2-EDTA）：称取5g三氯乙酸，用蒸馏水溶解稀释至100ml。再称取186mgNa2-EDTA·2H2O，加入到100ml50g/L三氯乙酸溶液中溶解。0.1mol/L磷酸钠溶液缓冲液（pH7.7）：配制办法见附录。0.1mol/L(pH6.8)磷酸钠缓冲液：配制办法见附录。4mmol/L二硫代硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoicacid，DTNB）溶液：称取15.8mgDTNB，用0.1mol/L、pH6.8磷酸缓冲液溶解，定容至10ml，混匀，4℃保存。现用现配。100μmol/L还原型谷胱甘肽原则液：称取3.1mg还原型谷胱甘肽，加入少量无水乙醇溶解，加蒸馏水定容至100ml。实验材料同抗坏血酸。【实验环节】原则曲线制作取6支试管，编号，按照表1加入多个试剂，混匀，25℃保温反映10min。以0号管为参比调零，测定显色液在412nm处的吸光度。以吸光度为纵坐标，还原型谷胱甘肽物质的量（μmol）为横坐标，绘制原则曲线。项目试管号012345100μmol/L还原型谷胱甘肽原则液/ml00.20.40.60.81.0蒸馏水/ml1.00.80.60.40.200.1mol/LpH7.7磷酸缓冲液/ml1.01.01.01.01.01.04mmol/LDTNB试剂/ml0.50.50.50.50.50.5相称于还原型谷胱甘肽物质的量/μmol020406080100提取取材后，称取2.5g样品置于研钵中，加入5ml经4℃预冷的50g/L三氯乙酸溶液（含5mmol/LNa2-EDTA）,在冰浴条件下研磨成匀浆后，于4℃、1g离心20min。收集上清液来测定谷胱甘肽含量，测量提取液体积。测定取1支试管，依次加入1ml蒸馏水、1ml0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.7）和0.5ml4mmol/LDTNB荣毅仁，混匀，即为绘制原则曲线的0号管液。以此溶液作为参比，在波长412nm处对分光光度计进行调零。另取2支试管，分别加入1ml上清液、1ml0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.7）。向一支试管加入0.5ml4mmol/LDTNB溶液，另一支试管中加入0.5ml0.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.8），将两支试管置于25℃保温10min。按照制作原则曲线的办法，快速测定显色液在波长412nm处的吸光度，分别记作ODs和ODc。重复3次。【计算成果】n×VVs×m显色反映后，分别统计样品管混合液的吸光度（ODsn×VVs×m还原型谷胱甘肽含量（μmol/g）=式中，n为由原则曲线查的的溶液中还原型谷胱甘肽物质的量（μmol）；V为样品提取液总体积（ml）；Vs为吸取样品液体积（ml）；m为样品质量（g）。【注意事项】1.在提取样品时，需要沉淀出去蛋白质，以方志蛋白质中所含巯基及有关酶对测定成果的影响。2.运用本办法还能够测定样品中总谷胱甘肽（GSSG+GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）的含量。在谷胱甘肽还原酶（GR）作用下，将GSSG还原成GSH再进行测定和计算。3.建议在第一次测定时先做2或3个样品本底对照，如果样品中本底对照和空白对照非常靠近，则阐明样品液中不存在干扰物质，能够不再检测样品本底对照。MDAR(单脱氢抗坏血酸还原酶)活性的测定（MustafaErkanandWen-ChiHou,,1999）MDAR提取：普通取0.2g材料于预冷的研钵中，分三次加入0.05mol/L（PH7.3）的磷酸钾缓冲液（预冷）1.8ml（难磨的材料能够加入适量的石英砂），在冰浴上研磨至匀浆，然后移到2.0ml的离心管（冲洗），于4℃1r/min下离心20min，上清液即为MDAR粗提液，将其放入冰箱中备用（-20℃或-80℃，在液氮中快速冷却）。MDAR的测定：酶活性的测定的反映体系涉及：2.7ml的预冷磷酸钾缓冲液（0.05mol/L，pH7.3）+0.1ml的NADH（0.2mmol/L）+0.1ml的ASA（1.0mmol/L）+0.001ml的AAO（1.0U）+0.1ml的酶提取液，以不加酶液的体系为对照，在340nm下测OD值的变化。GR（谷胱苷肽还原酶）测定试剂配备50mMPBS（K）（pH7.0，含0.2mmolEDTA,与APX的相似）：K2HPO4·3H2O6.9607g+KH2PO42.6538g混合后定容到1L；然后加入292.25×0.2=58.45gEDTA;10mMGSSG（用水配）：612.63×10×0.001=6.126g溶于1L水中;2.4mMNADPH（用PBS配）：833.4×2.4×0.001=2.0g溶于1L水中.实际配备50mMPBS（K）:3个解决*2个品种*3次重复*1.7ml*3次测定=91.8ml;（实际配备150ml,实际用量58.45g*0.15=8.7675g）10mMGSSG:3个解决*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml;（实际配备50ml,实际用量6.126g*0.05=0.3063g）2.4mMNADPH:3个解决*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml;（实际配备50ml,实际用量2.0g*0.05=0.1g）二、测定环节用3mL比色杯，依次加入1700µL50mMPBS（K）（pH7.8，含0.2mmolEDTA），100µL10mmolGSSG，100µL2.4mmolNADPH，100µL酶液（叶绿体悬浮液，与APX相似）启动反映，25℃，以NADPH启动发应（指最后加NADPH），测定OD340