重组蛋白药物研究进展解析

转自<丁香园>重组蛋白药品也称rDNA药品,不涉及重组疫苗、单克隆抗体药品(抗体药品的市场和研发趋势另有文章详述[1]、检测用重组蛋白和生化提取的天然蛋白,也不涉及仿制药品。重组蛋白药品即使仅占全球处方药市场的7-8%左右,但是发展非常快速,特别到了21世纪其发展更是进入黄金时节,1989年的销售额为47亿美元,为285亿美元,达成347亿美元[2],约410亿美元,是1989年的9倍。相对小分子药品,重组蛋白药品生产条件苛刻、服用复杂和价格昂贵,但对于有些疾病的治疗是不可替代的。绝大部分重组蛋白药品是人体蛋白或其突变体,以弥补某些体内功效蛋白的缺点或增加人体内蛋白功效为重要作用机理,其安全性明显不不大于小分子药品,因而含有较高的同意率,同时,重组蛋白药品的临床实验期要短于小分子药品,专利保护相对延长,给制药公司更长的独家销售时间[3]。这些特点成为重组蛋白药品研发的重要动力。从重组蛋白药品市场的地理分布角度,美国和欧洲占有全球市场的81%[4]。重组蛋白药品研发公司6强(Amgen,BiogenIDEC,Johnson&Johnson,EliLily,NovoNordisk和Roche全部来自美国或欧洲,占有75%市场份额[2]。从新药上市的数量和速度看,美国居首位,这与美国拥有较自由的药品价格环境以及医生接受新药的需求和高速度有明显关系。欧洲近几年发展也较快,率先同意上市了转基因动物(羊生产的重组人抗凝血酶(美国GTC生物治疗公司[5],以及第一种重组蛋白药品的仿制药品(Biosimilar,通用名生物药,下通称重组药品仿制药[6,7],后者结束了数年来重组蛋白药品与否能有仿制药的争论。鉴于美国和欧洲事实上主导着全球市场,分析其市场和研发趋势,也就能精确把握重组蛋白药品整体发展的脉搏。专家们对“新”重组蛋白药品的定义不尽相似,因此,不同文献中的新重组蛋白药品统计数量可能存在较大的差别。本文以在美国和/或欧洲新上市的重组蛋白药品注册品名为准(下列通称重组药品,计有82个,涉及15个“重磅炸弹”,后者销售额即达278亿美元,占销售总额的66%。现在的研发重点在于解决生产能力局限性、更加合理的变化重组药品构造和给药途径多样化。尽管重组药品发展面临着种种挑战,但是我们认为该市场会持续发展,并在前后达成峰值,那时将可能有新的替代治疗大量获准上市。剩余短短的十几年可能是我们发展重组药品的最后和最佳机会。一、上市重组药品的销售状况分析本文借用经济学“市场细分”的办法,从重组药品种类的销售入手,比分析适应症的市场规模能更直观地反映市场发展趋势。根据功效和性质,重组药品可分8类16种。促红细胞生成素Procrit最为畅销,近5年销售额近180亿美元;融合蛋白Enbrel销售增加最快,的销售额是的4.3倍,达36.5亿美元。(注:下文中括号:制药公司及与药品商品名对应的重组蛋白化学名称1、多肽类激素药:(1人胰岛素,适应症是糖尿病。1982年第一种重组人胰岛素Humulin(EliLilly上市,现在共有12种制剂(NovoNordisk的8个速效、中效和长效重组胰岛素突变体在此仅计为1个,涉及3个“重磅炸弹”,Humulin(野生型胰岛素、Humalog(EliLilly,胰岛素突变体、Lantus(Anvents,胰岛素突变体,重组人胰岛素的销售额最少达75亿美元[14,16,18]。(2人生长激素,适应症是生长激素缺点、发育障碍和AIDS有关耗竭病。1985年第一种重组人生长激素Protropin(Genetech上市,现有8个品种。重组人生长激素的重要产品Nutropin/Protropin等在的销售总额约为13亿美元[10,18,23]。(3卵泡刺激激素(3个和其它激素(7个,适应症是是不育症、调节排卵、更年期骨质酥松等,尚未形成很大的市场。2、人造血因子:(1重组人促红细胞生成素,适应症是贫血。1989年上市第一种重组人促红细胞生成素Epogen(Amgen,现有的5个产品中4个是“重磅炸弹”,Aranesp(Amgen,Epoetinα突变体、Neorecormon(Roche,野生型Epoetinβ、Procrit(Johnson&Johnson,野生型Epoetinα和Epogen(野生型Epoetinα,销售累计为91.5亿美元。(2粒细胞/单核细胞集落刺激因子GM-CSF,适应症是癌症或癌症化疗引发的感染防止和治疗。仅有的3个产品2个是“重磅炸弹”,Neulasta(Amgen,PEG化的GM-CSF和Neupogen(Amgen,GM-CSF突变体,销售总额为35亿美元。(3其它造血有关因子(5个,适应症重要是小朋友发育不良以及恶性血液病或糖尿病的并发症。3、人细胞因子:(1α干扰素,适应症为慢性病毒性肝炎和某些癌症。1986年第一种重组人α干扰素Roferon(Huffman-LaRoche上市,现有5个同类产品,其中2个(组为“重磅炸弹”,一是Pegasys(Roche,PEG化的重组人α干扰素-2a,另一组是ScheringPlough的PEG-IntronA/IntronA,销售额累计约21.6亿美元。(2β干扰素,适应症为多发性硬化症(MS。3个产品都是重磅***,Rebif(Serono,野生型β干扰素1a、Avonex(Biogen,野生型β干扰素1a和Betaferon/Betaseron(ScheringAG,β干扰素1a突变体,销售额累计40亿美元[19]。(3其它细胞因子(4个,涉及白细胞介素1、2和11的突变体,适应症为肿瘤化疗引发的血小板减少症、肾细胞癌和慢性肉芽肿疾病等[20]。4、人血浆蛋白因子:(1重组人凝血因子VIII,适应症是血友病A。最早上市的为Recombinate(Baxter和Genetics,野生型,现有5个同类产品,最畅销的是Kogenate(Bayer,野生型及Advate(Baxter,野生型,销售分别为8亿[21]和6亿美元[22]。(2重组人凝血因子VII,仅上市NovoSeven(NovoNordisk,适应症是血友病和止血,的销售额近10亿美元,上六个月销售增加19%。(3重组人凝血因子IX,仅Renefix(Genetics1个,适应症是血友病B。(4组织血浆酶原激活物tPA,最早上市的为Activase(Genetech,现有4个品种,适应症是急性心肌梗死,市场规模为6-8亿美元[23]。(5C反映蛋白,适应症是严重败血症,仅Xigris(EliLilly1个。(6重组人抗凝血酶(ATryn是同意的、第一种由转基因动物(羊生产的重组药品。5、人骨形成蛋白(2个:是最年轻的一组,第一种产品同意上市。Wyeth的成骨蛋白销售额达2.4亿美元[17],适应症为急性胫骨骨折、脊椎愈合和增进骨愈合等。6、重组酶:适应症为先天性酶缺点的替代治疗。1993年第一种重组酶Pulmozyme(Genetech上市,适应症是肺纤维化,的销售6亿美元[23],共有8个不同重组酶产品。7、融合蛋白:是为数极少的以克制为作用机理的重组药品,仅有3个。1998年同意的Enbrel(Amgen是TNF受体和IgG的Fc片段的融合蛋白,含934个氨基酸,适应症为风湿性关节炎,为“重磅炸弹”,近5年的销售额约100亿美元。1999年上市的免疫毒素Ontak(Ligand[24],适应症是皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL,是缺失细胞结合域的白喉毒素与IL-2的N端133个氨基酸的融合蛋白。上市的Amevive(BiogenIdec[25]是LEF-3的CD2与IgG的Fc片段的融合蛋白,适应症是牛皮癣。8、外源重组蛋白:外源蛋白能够用于人的疾病治疗,这在单克隆抗体药品发展过程中已经得到了验证。但是,至今同意上市的只有1个重组水蛭素(hirudin[20],适应症为血栓性疾病。重组药品最大的一类是重组人促红细胞生成素,近5年销售总额近430亿美元;后来依次是重组胰岛素(除“重磅炸弹”外,总销售额用NovoNordisk的对应产品销售额进行调节,由于该公司占有胰岛素市场的近50%份额、β干扰素、GM-CSF、融合蛋白Enbrel以及α干扰素。由于重组血浆蛋白中没有单一“重磅炸弹”,因此没有列入“重磅炸弹”中进行比较,但其在的总销售额已达成30亿美元[18,21-23]。时隔5年,占市场前3位的重组药品名次没有发生变化,只是由于Enbrel的快速增加造成各自的份额有所下降,Enbrel在已上升至与GM-CSF并列第四名,α干扰素降至第六位。重组人促红细胞生成素的适应症已经从肾衰性贫血扩大至癌症或癌症化疗引发的贫血,并已有大量临床证据阐明重组人促红细胞生成素能够增进癌症病人的生活质量[26],其领头羊位置在将来5年将更加稳固。重组胰岛素占市场份额下降,但今年上市的肺吸入型胰岛素以及长效胰岛素和基础胰岛素等会支持市场不会下滑。β干扰素治疗MS将受到抗体药品和小分子药品的挑战,发展可能会受到克制。GM-CSF在临床使用中能够有效减少癌症化疗造成的中性粒细胞下降引发的感染,长效GM-CSFNeulasta一种化疗疗程使用一次,医生和患者接受程度很高,市场份额增加将一步加紧。Enbrel近5年增加幅度较大,但会受到抗体药品的有力挑战。α干扰素与利巴韦林联合治疗慢性病毒性肝炎疗效明显[10,12],在获得肝炎大国日本同意后,其必会有更大的增加空间。明年,NovoSeven可望成为“重磅炸弹”,会带领重组血浆蛋白使整体市场份额格局有较大调节。其它类重组药品近5年内不会形成很大市场。二、研发趋势重组药品的快速发展有着必然性,但要持续发展,有几个问题必须解决或优化,涉及生产载体与产量、基因工程改造和翻译后修饰以及用药途径。1、生产载体与产量生产能力局限性已经成为重组药品发展的瓶颈。以Enbrel为例,在1998年上市6个月内仅美国销售就超出对全球全年需求的预计[27],生产规模缺口很大。又如,HIV蛋白微球(microbicides在局部使用能够避免HIV传输,但至今未进入临床研究,因素也是生产量不够[28]。尚有诸多药品不仅发展中国家用不上,即便是发达国家也难以使用,预计有80%的血友病患者无药可用,重要是生产能力局限性。生产能力局限性也造成其价格不菲。哺乳动物细胞和大肠杆菌(E.coli是上市重组药品最重要的生产载体(见图4。E.coli用于体现不需要翻译后修饰的重组药品,如胰岛素、生长激素、β干扰素和白细胞介素等。糖蛋白重组药品除刚同意上市的ATryn以外,全部在哺乳动物细胞中体现。Activase是第一种由哺乳动物细胞体现的上市重组药品,Epogen是第一种由哺乳动物细胞体现的“重磅炸弹”药。CHO细胞是最为惯用的生产载体之一,其糖基化近来似人的糖基化构造,但糖基化产物是不均一的混合物。BHK细胞是第二惯用的,另外,NSO、HEK-293和人视网膜细胞体现的蛋白也获得过同意。现在,哺乳动物细胞的产量亟待提高。上个世纪80年代,培养细胞密度最大达成2X106/ml,生产期7天,特异产物量为50mg/L。的数据显示,细胞密度最大可达成10X106/ml,有效体现时间达成3周,体现量靠近5g/L,是1980s的100倍[29],现在世界上最大的细胞发酵罐达成2万升。哺乳动物细胞生产体系还需要解决的其它问题涉及无血清培养基、延迟细胞凋亡和糖基化改善等[30]。酵母细胞即使能够糖基化,但是与人的糖基化有很大差别,为高度木糖醇型,体现的重组药品在体内半衰期很短并有潜在的免疫反映。因此,该领域最可能获得的突破是“人源化”P.pastoris酵母[31],能生产均一、与人糖基化相似的糖蛋白,靶蛋白的产量可达成15g/L,是哺乳细胞的3倍,对哺乳动物细胞体现体系形成有力挑战。另一种正在获得突破的是植物体现体系(molecularfarming,植物糖基化免疫原性低,不易诱发过敏,但有可能变化某些糖蛋白的功效。现在已用于10多个重组药品候选者的体现,其中1个已进入II期临床[28]。该体系尚需解决的问题有,进一步提高体现产量、通过“人源化”改造糖基化构造以及评价生产体系对环境的影响。已有了突破的转基因动物生产方式最少在近期不会成为主流,其问题在于转基因高等哺乳动物乳液蛋白糖基化仍有别于人,可能造成抗原性的变化。欧盟人用医学制品委员会(CHMP曾对ATryn上市提出过反对意见,理由是临床例数太少。另外,美国Genzyme公司重组人酸性α-葡萄糖酶(商品名Myozyme,原本在转基因兔奶中生产,最后换为CHO细胞生产并获得FDA同意上市[20]。转基因鸡的蛋青也可高水平体现重组药品,但现在尚无任何一种转基因鸡制备的药品被同意,重要问题仍是糖基化问题。固然,如果药品是口服和局部使用,抗原性问题将可能被无视。2、重组药品的基因工程改造和翻译后修饰高度纯化的重组蛋白与人内源蛋白相似或高度相似,能避免出现免疫反映。但有30%左右重组药品是通过基因工程变化或通过其它手段进行翻译后修饰的(图5,也有文献指出现有上市重组蛋白药品种基因改造率达38%。变化蛋白的构造的目的是为了优化其药代动力学,但又不能弱化其生物功效及产生新的抗原性。以重组人胰岛素为例,有多个基因工程变化序列的产品,重要是B28、B29和B30位的氨基酸变化。第一种经基因工程变化的重组人胰岛素为Lispro,是B28、B29之间的颠换,使产生双聚体和多聚体的可能性比野生型减少300倍[32],能够更快地释放入机体,起到速效的作用。缺失突变体也比较常见,ReFacto(重组凝血因子VIII,销售额2.5亿美元就是缺失突变体[33],对体内出现因子VIII克制物的血友病患者有较好疗效。近来研究表明,Ankyrin重复(出现在erythrocytes等中,由33个氨基酸构成,有β折角反向平行和α螺旋有助于加强重组药品靶标记别、膜蛋白的朝向性和稳定性[34]。但是,基因工程变化序列应非常谨慎,某些很小的变化就可能造成蛋白构象较大变化,从而诱发免疫反映。翻译后修饰重要涉及脂化和PEG化。脂化是指将脂肪酸共价定点连接在蛋白上,从而增加药品与血清白蛋白的亲和力,延长在血清中的循环时间,发挥长效作用。PEG化分为单一PEG化和多点PEG化,通过减少血浆去除率、减少降解和受体介导的摄入,也能达成长效的目的,同时屏蔽抗原表位提高药品的安全性。PEG-干扰素α(Pegasys和PEG-Intron和PEG-GCSF都是PEG化成功例子[35]。融合蛋白是指不同蛋白的不同功效域通过基因工程手段构建成一种蛋白,但愿含有双功效或新的功效。即使在这方面进行了大量的尝试,但是,25年来仅有3个被同意,提示其难度之大。外源蛋白更是只有1个成功例子。3、给药途径的变革绝大多数重组药品是注射给药或静脉途径,仅有2个是喷雾剂,如Pulmozyme即是一种液体喷雾剂。有些疾病如糖尿病、肾衰性贫血等都需要长久使用药品,注射或静脉途径的方式非常不便利,从而人们在给药途径上进行了大量的尝试。,终于有了重大突破,Pfizre和Avents的肺吸入型胰岛素Exubera获得同意在美国和欧洲上市。作为干粉,肺吸入性剂型比液体喷雾剂稳定,剂量也好掌握。固然,Exubera价格昂贵,以至英国有关部门回绝使用,由于每七天每个病人为此要多付出18美元。无论如何,这将变化众多糖尿病患者的治疗方式,减除他们的痛苦,也激发了其它药品替代注射途径的研究热潮。我国有几家科研机构和公司研究透皮给药和肺吸入给药方式已经获得了可喜的进展。但是,应当指出,肺吸入型胰岛素在1999年就已经进入III期临床研究[36],至今才获得同意,难度可想而知。在这方面,最大的技术难点是给药剂量的精确度和药品稳定性等。三、重组药品面临的问题和挑战有分析家把重组药品市场喻为美丽的蝴蝶。但是,蝴蝶能飞多久呢?又会如何演变?换句话,重组药品市场与否进入了成熟期?近再没有出现对市场有较大影响的新产品类别,R&D投入相对稳定(生物公司-持续3年的R&D总额均稳定在150亿美元[37]都是市场过于成熟的体现,将使持续发展受到限制,这是来自其本身的挑战。客观分析其它治疗技术的发展,我们认为重组药品市场在近期不会遇上真正意义上的挑战,但潜在的威胁确实存在。1、其它治疗药品或办法对重组药品市场的挑战重组药品的诸多适应症是由于单基因或明确的简朴因素造成的某个蛋白的缺少或功效丧失,如血友病和I型糖尿病,非常适合基因治疗。构想一下,如果能在人体内可调控地体现重组药品的基因,重组药品市场将走向何处?基因治疗在短期内与否会较大地影响重组药品市场?事实是,从1989年起,约1140个基因治疗产品进入临床研究,仅有少数几个进入临床III期研究[20],并且没有1个在美国和欧洲上市,并有许多由于临床研究出现意外死亡而终止。现在,世界上只有我国11月同意上市了以人p53基由于基础的基因治疗“今又生”。美国同类产品早已进入3期临床,迟迟未能上市的因素是美国FDA同意的基础是5年存活率的变化,而我国是以肿瘤变小为同意根据的。基因治疗要在下列核心领域获得突破才可能大批量的进入市场:目的基因传送的特异性、稳定性、可控性和抗原性。能够预见,5-内基因治疗难以对重组药品形成有力挑战。干细胞诱导生成胰岛(样细胞的办法也没有得到预期的进展,走向临床的路可能比基因治疗更为遥远。抗体药品或aptamer是以特异靶向结合和克制被结合物为作用机理的,而绝大多数重组药品是以补充蛋白(功效为作用机理的,因此无论是抗体药品还是aptamer仅会对克制作用为机理的重组药品产生严重挑战,如Enbrel和β干扰素。2、重组药品仿制药时代对重组药品市场格局的影响现在药品市场的规则是:新药专利保护期过后,将有通用名药品上市,其价格是新药的15%左右,极大影响药品利润。如,持续5年的处方药销售亚军Zocor(小分子降血脂药的专利保护今年到期,其通用名药将不仅影响Zocor的价格也将使降血脂药品整体价格下滑。有几个在1980s的重组药品已经丧失或即将丧失专利保护，预计将来5年将有价值100亿美元以上的重组药品将失去专利，会不会涌现出一批重组药品仿制药颠覆重组药品市场？欧洲在年初次同意了2个重组药品仿制药上市，为人生长激素的2个不同版本，Omnitrope和Valtropin，这与否预示重组药品仿制药时代的到来？事实上，重组药品的状况远比小分子药物复杂。欧洲有生长激素、Epo、GM-CSF和胰岛素仿制药品的指导原则，但是对构造和加工较为复杂的PEG蛋白和凝血因子还没有考虑。美国如何发展重组药品仿制药还存在很大争议，美FDA还没有公布有关的指导原则。最重要的考虑是安全性，与小分子药品不同，即使是同一种基因在同种细胞中体现并使用类似的加工方式，重组药品仿制药也难以确保与原创药完全相似。考虑生产成本和加工的复杂性，重组药品仿制药对现有市场的影响还不明显。但是，重组药品仿制药时代一定会到来，并会对重组药品市场格局产生重大影响。3、临床安全存在风险因素犹如其它药品同样，重组药品也存在引发副作用的风险。首先，重组药品的功效并不是单一的，或者其作用程度很难精确控制，有可能造成严重的副作用。例如，有专家认为用重组促人红细胞生成素纠正癌症病人贫血的同时可能增进肿瘤的生长[26]。类似的，重组人生长激素会刺激肿瘤生长、增加血脂升高和糖尿病发病的风险。而应用tPA治疗“中风”会引发出血倾向，有研究提示与血清基质代谢蛋白酶9（MMP9）关系亲密[33]。另首先，患者出现针对重组药品抗体，因素重要是糖基化差别和改构产生的新抗原表位(特别是T细胞表位，其临床体现类型和程度难以预料。最为常见的是造成治疗效果不好甚至无效，严重时会出现致命合并症，如抗重组促人红细胞生成素抗体造成红细胞再障（RBCA）[6]，因素不明。临床安全风险是影响新药审批速度的直接因素，也势必会影响市场发展。四、几点思考即使重组药品的发展面临挑战，但近期仍将以较快的速度发展，年前后有可能成为重组药品发展的分水岭，具体时间取决于本身的瓶颈问题与否能解决，替代疗法与否能够出现。无论如何，我们现在面临的可能是最后的发展机遇。我国重组蛋白研究非常普遍，任何一种有规模的研究机构都有基因克隆和突变的平台。许多制药公司也都有大规模细胞培养和纯化的体系，含有研发和生产重组药品的条件。但是，要抓住这次机会，必须冷静地分析形势，高起点地开展工作。1、客观选择重组药品种类作为研发起点重组人促红细胞生成