植物中小分子rna的高通量测序研究进展

植物中小分子rna的高通量测序研究进展

0焦磷酸高通量测序技术小分子rna（小型钠）是一个非编码的rona分子，具有20.30%的长度。自从1993年首次在秀丽线虫(Caenorhadits,elegans)中被发现后,人们越来越多地意识到小分子RNA的重要作用。相对于小分子RNA的巨大数量,传统的Sanger测序法操作复杂,花费大,测序深度有限,效率较低,因此在很大程度上制约了植物小分子RNA的发现速度。自2005年以来,人们开始采用以大规模平行标签测序技术(massivelyparallelsignaturesequencing,MPSS)、454-FLX(454lifesciences)和Solexa(illumina)测序技术为代表的新型焦磷酸高通量测序技术(pyrosequencing)来发掘植物小分子RNA。这些第2代测序技术尽管获得的序列较短,但具有速度快、成本低、覆盖度深、产出巨大等优点,因此非常适合小分子RNA测序,尤其是对那些拷贝数低的小分子RNA。以最早发现的microRNA(miRNA)为例,互补链的出现已成为衡量其是否为miRNA基因的充分必要条件。而miRNA互补链在miRNA形成后即进入降解途径,因而拷贝数极低,利用传统测序技术一般无法检测到。因此,高通量测序技术可大大促进植物小分子RNA基因的发现过程,为研究小分子RNA的合成机制和生物学功能及其在物种间的进化规律提供大量信息。鉴于小分子RNA在植物生长、发育和应答外界胁迫等方面具有重要功能[12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23],有关其生物合成和功能研究已有多篇综述。所以,本文在简单介绍各种植物小分子RNA特点的基础上,侧重总结近几年利用高通量测序技术挖掘植物小分子RNA的研究成果,以期反映高通量测序技术在加速植物小分子RNA发现、促进植物小分子RNA功能研究以及提高人们对植物小分子RNA进化的认识等方面的最新进展。1植物小分子rna的合成根据植物小分子RNA生物合成途径的不同,大致上可将其分为微小RNA(microRNA,miRNA)和小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)两大类型。其中siRNA又分为天然反义siRNA(naturalantisensesiRNA,nat-siRNA)、反式作用siRNA(trans-actingsiRNA,ta-siRNA)和异染色质小RNA(heterochromaticsmallRNA)。植物小分子RNA的生物合成过程需要多种蛋白和酶的参与。在拟南芥中,III型核糖核酸酶(dicer-like,DCL)、RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase,RDRP)以及Argonaute蛋白(AGO)等都是小分子RNA生物合成路径的重要成员。1.1mirna的形成miRNA是第一类被发现并具有重要功能的内源单链小分子RNA,其长度为20～23核苷酸。每种植物中有上百个编码miRNA的基因(不同物种中的具体数目不一样),它们分别在不同的细胞和植物的不同发育阶段表达。miRNA基因经转录后形成miRNA的转录本(pri-miRNA),然后在HYL1(hyponasticleaves1)、DCL1和SE(serrate)的相互作用下形成miRNA前体(miRNAprecursor或premiRNA)。Pre-miRNA能够形成具有茎环特征的二级结构。miRNA则位于茎环结构的茎上。一般来讲,pre-miRNA被DCL1切割形成miRNA/miRNA*寡核苷酸二聚体。这些二聚体经甲基转移酶HEN1(HUAenhancer1)对其3′末端碱基进行甲基化修饰后成为成熟miRNA。然后成熟的单链miRNA被组装到含有AGO蛋白的RISC(RNAinducedsilencingcomplex)中。而miRNA*则被逐步降解。miRNA在RISC的引导下通过切割靶基因转录本或抑制其翻译来行使基因沉默的功能。1.2ta-sirna靶基因的结构siRNA是一类由长的双链RNA(doublestrandRNA,dsRNA)产生的小分子RNA。基因组上的许多位点都可以产生siRNA。在植物中,内源siRNA可以直接来源于转录本、转基因的反向重复序列以及转座子等。到目前为止,3类siRNA的生物合成已比较清楚。第1类叫做nat-siRNA,它们产生于同一基因组位点上序列部分重叠的双向转录本,其生物合成需要RDR6及1个或2个DCL蛋白的参与。目前研究最清楚的2个nat-siRNA分别产生于生物胁迫和非生物胁迫条件下,通过下调参与产生nat-siRNA的2个基因中的1个基因的表达来实现其功能。第2类siRNA叫做ta-siRNA,它是1类反式作用的内源siRNA。ta-siRNA调控的靶基因序列和产生ta-siRNA的序列分别位于基因组的不同位点。在拟南芥中,TAS(ta-siRNA)家族的4个基因(TAS1～4)自身都是miRNA的靶基因,其转录本在特定位点被相应的miRISC剪切,切割的片段被SGS3稳定后,在RDR6的作用下合成dsRNA,再由DCL4将dsRNA切割成21nt长的ta-siRNA,最后ta-siRNA在AGO1或AGO7的参与下行使其功能。已报道的ta-siRNA靶基因包括生长素应答因子ARF3(auxinresponsefactor3)和ARF4。第3类siRNA为hcRNA,它们大多数产生于基因组中的转座子、反转录元件以及重复序列转录来的dsRNA前体,并倾向于分布在被甲基化修饰的基因组区域。在生物合成时,首先在RDR2的作用下形成dsRNA,然后由DCL3将其剪切、HEN1对剪切产物进行甲基化修饰,最终形成长度为24nt的成熟siRNA,接着siRNA与AGO4或AGO6结合,形成AGO-siRNA复合体,在DRD1(defectiveinRNA-directedDNAmethylation1)和聚合酶Ⅳb(polymeraseⅣb)的协作下,由甲基转移酶DRM2(domainrearrangedmethyltransferase)在相应的基因组位点上进行胞嘧啶(cytosine,C)或组蛋白H3第9位赖氨酸的甲基化[31,54,55,56,57,58,59]。其它类型的小分子RNA,如在哺乳动物中由于与piwi蛋白互作而得名的长度为25～31nt的piRNA(piwi-interactingRNA),在植物中尚未有报道[31,60,61,62,63,64]。2小分子rna的测序结果利用高通量测序技术进行植物小分子RNA研究的最早发现是小分子RNA数量巨大和种类繁多。起初人们认为这些非miRNA的小分子RNA可能来自目标基因的随机断片。但大量siRNA的反复出现及其在基因组上广泛而规律性的分布逐渐使人们意识到它们可能是由细胞内特定的机制所产生的。现在,人们已经知道植物小分子RNA直接参与染色体修饰和基因表达调控。2005年,Meyers实验室第1次应用大规模平行测序技术(MPSS)对4个拟南芥小分子RNA文库进行了测序。对2.21×106条长度7～11nt的序列标签进行分析之后,结果令人吃惊地发现有1/2以上的拟南芥小分子RNA来自于基因组的重复序列或基因间的非编码序列,尤其是那些原来认为没有任何转录特征的区域居然也有大量的小分子RNA产生。这一结果恰好解释了在以前研究中所观察到的现象,即:染色体上富含转座子的异染色质区的甲基化和乙酰化与siRNA经常同时出现,说明植物染色体的DNA甲基化或组蛋白乙酰化修饰依赖于小分子RNA的介导作用。Sunkar等也系统分析了拟南芥基因组上产生siRNA位点的甲基化和乙酰化的情况,发现大多数产生siRNA的位点与该位点DNA或组氨酸的甲基化和乙酰化程度紧密相关,尤其是重复序列富集的异染色质区域。这一研究结果后来在拟南芥的相关研究中也得到了进一步证实。最近,Tanurdzic等综合基因芯片、染色体重叠芯片、甲基化、乙酰化染色质免疫沉淀DNA芯片分析及小分子RNA测序等多种高通量技术,研究了拟南芥第4染色体在野生型和悬浮细胞中染色质的表观遗传学修饰的变化情况。结果表明,在悬浮细胞的形成过程中,染色质上基因编码区和启动子区的甲基化程度增加,而大部分富含重复序列和转座子的异染色质区甲基化程度下降,同时伴有部分转座子的激活表达。从小分子RNA角度来看,转录激活的转座子位置上长度21nt小分子RNA的数量大大增加。由于长度24nt小分子RNA的绝对数量并未变化,作者推测长度21nt小分子RNA的数量增加可能与上述部位甲基化程度下降有关,进而导致转座子的激活。总之,迄今为止的研究表明,小分子RNA随着许多生物学过程的变化而发生变化,但对其工作的机理却仍然知之甚少。规模化小分子RNA的克隆和测序分析将为全面、深入研究植物小分子RNA的生物学功能提供最基本的素材。3小分子rna在细胞发育中的作用通过建立基因的表达模式来帮助确定其功能是现代分子生物学研究的常用方法。已有研究表明,与蛋白编码基因一样,植物在不同发育阶段、不同组织和应答不同环境胁迫条件时均有不同的小分子RNA群体在起作用,因而表现出不同的小分子RNA组成及其表达模式。因此,利用高通量测序技术对特定发育阶段或特定胁迫处理的植物材料进行全面地小分子RNA表达分析,对发现参与上述过程的重要小分子RNA是非常有效的方法。在单子叶植物如小麦中,Yao等用454-FLX测序法大规模测序分析了1个由小麦叶片、根和果穗等组织组成的混合小分子RNA文库(表)。通过对超过2.6×104个小分子RNA序列进行分析,得到58个小麦miRNA基因,包括35个种间保守的miRNA和23个小麦特有的miRNA。Northern分析表明小麦miR512和miR513分别在小麦的幼穗和根中特异表达,说明它们可能特异参与了小麦幼穗和根的发育。另外作者还发现了4个单子叶植物特有的miRNA:miR506、miR510、miR514和miR516,表明这些小分子RNA可能参与了单子叶植物特有的发育过程。同样,为了分离参与水稻不同组织发育过程特有的小分子RNA,Nobuta等用MPSS方法分别测序分析了来自水稻花序、茎秆和幼苗3个组织的小分子RNA。对3个文库的比较分析表明,幼叶和茎秆中的小分子RNA在基因组上的分布规律很相似,而它们与花序中小分子RNA在基因组上的分布情况存在较大差异,说明在营养生长和生殖生长2个特定阶段有不同的小分子RNA群体发挥作用。这一结果与本实验室在短柄草中的研究结果类似,即在短柄草营养生长和生殖生长2个阶段数百万的小分子RNA群体中,只有极少部分相同,说明植物不同器官的生长发育有着不同的小分子RNA参与。在双子叶植物中,Moxon等利用454-FLX法分析了番茄叶片和果实中的小分子RNA表达情况。结果表明,番茄miR390和miR1917在果实中的表达量远高于在叶片中,而且miR1917的靶基因LeCTR1在番茄成熟过程中应答乙烯时表达量显著下调,因此认为这2个miRNA可能参与了番茄果实的发育过程。miRNA的表达情况随着各种生物和非生物胁迫的发生而发生变化。如Sunkar等为了获得水稻应答盐和干旱胁迫相关的小分子RNA,采用454-FLX法对来自盐和干旱处理条件下生长四周的水稻幼苗的小分子RNA进行了深度测序。在所获得的3.3×105个小分子RNA序列中,作者不仅发现了已知的46个水稻miRNA家族,同时还获得了23个新的低拷贝miRNA和40个候选miRNA。对这些特定处理条件下获得的miRNA的进一步研究,有望揭示小分子RNA在植物组织发育和应答环境胁迫中的作用,为彻底认识植物抗寒抗盐的分子机理提供重要的线索。又如Subramanian等对经慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)侵染3h后的大豆根的小分子RNA文库进行测序分析之后,获得了3.5×105个小分子RNA序列。他们发现的小分子RNA涵盖了50%以上的大豆miRNA,其中miR159在慢生根瘤菌侵染大豆3h后表达量急剧上升,表明它可能参与了大豆对该菌侵染过程的应答。杨树是目前植物中第3个具有全基因组序列的物种。早在2005年,Lu等就用传统的Sanger测序法系统分析了杨树在木质部发育过程中的小分子RNA情况。鉴定出10个与杨树应答机械胁迫有关并且是木质茎秆所特有的小分子RNA。在这些小分子RNA中,有些在杨树受到拉伸和压缩时表达量下降,如miR156、miR162、miR164、miR475、miR480和miR481。而miR408的表达量则在杨树受到上述胁迫时表现为上调。另外,miR159、miR476和miR479特异响应杨树的压缩胁迫。有关木质部特异表达和机械应答miRNA的研究,为人们从小分子RNA的角度解释杨树应答机械胁迫的现象提供了重要依据。同时,利用高通量测序的方法,比较分析野生型植物和小分子RNA合成途径中的一些重要基因突变体中小分子RNA的表达差异是研究这些基因影响小分子RNA组成的有效手段。Lu等用MPSS和454-FLX方法分别对野生型拟南芥和rdr2突变体中的小分子RNA进行测序分析之后发现:在rdr2突变体中,ta-siRNAs和部分长度21nt的miRNA大量富集,而那些长度为24nt、来源于基因组上异染色质区的siRNAs的数量显著降低,说明RDR2在内源24nt长siRNA的生物合成中发挥重要作用。在玉米中,Nobuta等利用Solexa测序技术比较分析了野生型玉米和mop1(mediatorofparamutation1,拟南芥rdr2的同源基因)突变体的小分子RNA情况。结果发现,mop1中长度24nt的siRNA显著减少,而miRNA和ta-siRNA明显富集。另外,在玉米mop1突变体中出现了大量长度22nt的siRNA。这种现象在拟南芥rdr2突变体中则没有发现,说明在拟南芥和玉米小分子RNA的合成过程中,RDR2的功能有所不同。正如组织特异表达的蛋白编码基因一样,组织或发育阶段特异表达小分子RNA可能预示着它们在植物的重要生物过程中起着举足轻重的作用,因此对小分子RNA表达谱的分析将会大大促进相关基因功能的研究。4拟南东南角的mirna基因家族在种子测序中的表达miRNA作为基因组中一类数目众多的重要负调控因子,它们的出现是自然选择的结果,其进化过程在遵循类似蛋白编码基因共同规律的同时,又遵循作为非编码RNA基因的特有规律。目标基因反向复制机制(invertedduplication)是目前大家比较倾向的一种miRNA起源机制:即1个蛋白编码基因通过反向重复过程形成“头对头”或“尾对尾”部分或完全重叠的反向重复结构,这一结构可能被同一个启动子或不同启动子所启动转录。转录产物形成发夹结构,并作为DCL蛋白的底物从而产生miRNA,使得原来那个蛋白编码基因成为这个miRNA的靶基因。而所产生miRNA的多样性则来源于所形成的茎环结构的不同和DCL蛋白的识别差异。Fahlgren和Allen等利用454-FLX方法对野生型拟南芥和dcl1-7、dcl2-1、dcl3-1、dcl4-2、rdr1-1、rdr2-1、rdr6-15这7个拟南芥小分子RNA生物合成所需基因突变体的花序、野生型拟南芥和rdr6-15的幼苗以及经植物病原细菌(P.syringaepv.tomato)侵染和未经其侵染的拟南芥叶片为材料的共12个小分子RNA文库进行测序分析,发现了16个新的miRNA。同时,作者还发现这些新miRNA和miRNA*以及它们的侧翼序列与某些蛋白编码基因序列具有高度的同源性。更有趣的是,其中7个miRNA的靶基因就是与其同源的蛋白编码基因,而另外9个miRNA的靶基因则是其它基因。因此研究认为,有些新的miRNA来源于与其互作的靶基因家族的转录本,而另外一些则来源于与其没有互作关系的基因家族转录本。这一研究结果为植物miRNA起源的目标基因反向复制假说提供了有力证据,同时也说明miRNA基因的进化正经历着频繁的“诞生和死亡”(birthanddeath)过程,而在这一过程中,只有一部分miRNA基因能够最终稳定整合于基因组复杂的调控系统中。物种特异的miRNA或其在特定物种中拷贝数的扩增,表明这些小分子RNA在物种进化或应对环境胁迫过程中起着重要作用。植物miRNA的进化过程频繁而快速。高通量测序技术的出现尤其加速了拟南芥中低拷贝和新型miRNA的克隆,不断有拷贝数极低的miRNA被发现。有意思的是,在这些小分子RNA中有些衍生成员仍始终保持着较低的表达量,而另外一些的表达量则显著增加。这暗示着这些衍生的miRNA在功能上已逐渐发生了分化。2007年,Barakat等用454-FLX法分别对杨树叶片和花蕾2个组织中的小分子RNA进行了测序分析。对杨树、拟南芥和水稻中的miRNA的系统比较分析发现,90%以上的拟南芥miRNA在杨树小分子RNA文库中没有出现。同样,33个水稻miRNA家族在拟南芥或杨树的miRNA中也找不到对应的成员,表明杨树中新发现的miRNA大多数可能是杨树特有的。杨树特有的miRNA可能与杨树基因组经历了多次复制有关。在这些过程中,杨树miRNA拷贝数的显著增加为不同家族成员的功能演化提供了前提条件,使杨树能更好地适应环境变化,为其成为地球上比较成功的树种之一做出贡献。5mirna的发现和演化非编码RNA的核酸本质决定了它们具有与蛋白质调控因子完全不同的调控模式。单链RNA与其同源RNA或DNA的互补性以及它们在基因组中与邻近基因的相对位置等,都可以影响其基因的调控模式。前人的研究结果表明,基因组中位置重叠的两个基因可能被小分子RNA调控,叫做顺式自然反义转录本(cis-NATs,cis-naturalantisensetranscripts)。在拟南芥中,当两个重叠基因同时转录时,重叠部分可形成双链RNA(dsRNA),进而形成小分子RNA。这些由蛋白质编码基因即cis-NATs的外显子区域形成的siRNA叫做nat-siRNA。它们一般用于调控形成cis-NATs的2个基因中的1个基因。参与cis-NATs形成的2个基因的时空表达组合与随之产生的nat-siRNA形成“三重调控(tripleregulation)”模式。这一模式使NAT基因的调控机制变得异常精巧。nat-siRNA的功能在拟南芥中首先被发现,并的确参与了拟南芥的生物学过程。但以往发现的cis-NATs多由蛋白质编码基因组成。2008年,Lu等用MPSS方法对水稻日本晴未成熟花序、茎秆等6个小分子RNA文库进行测序分析后,发现miRNA也可以作为cis-NATs的成员,形成所谓的nat-miRNA。nat-miRNA位于与其靶基因重叠位点的反义链。与一般miRNA的区别在于:一方面在它们的基因序列中都存在内含子,因此茎环结构(pre-miRNA)须在内含子被剪辑后方能形成,然后经DCL1切割形成成熟miRNA;另一方面,nat-miRNA的前体与所调控的基因(都是MADS-box基因)在序列上有长约65nt的重叠,而成熟miRNA恰