蛋白质组学研究的现状与展望

蛋白质组学研究的现状与展望

蛋白质是生命的基础，是生命活动的最终控制和直接执行者。它参与了大多数生物生命活动的过程，如生长、发育、遗传、代谢、激酶、循环、信号传达等。100多年来,特别是20世纪生物化学和分子生物学技术的蓬勃发展,如氨基酸序列测定、多肽合成技术、X射线衍射技术、电子显微镜技术等,使人们认识到,蛋白质是一类结构和功能高度多样,并能对环境各种刺激做出自发响应的、复杂而神奇的“网络生命大分子”。随着后基因组时代(post-genomeera)的到来,科学家们的研究重心已经从解释生命的所有遗传信息转移到在整体水平上对生物功能的研究。采用差异显示反转录PCR、基因表达系列分析(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)、DNA芯片等技术从基因水平上阐述生命活动规律,其前提是细胞中mRNA的水平反映了蛋白质表达的水平,但事实并非如此。从DNA到蛋白质,存在3个层次的调控,即转录水平调控(transcriptionalcontrol),翻译水平调控(translationalcontrol),翻译后水平调控(post-translationalcontrol)。从mRNA角度考虑,实际上仅包括了转录水平调控,并不能全面代表蛋白质表达水平。蛋白质作为生命活动的最终体现者,有其自身固有的特点,如蛋白质复杂的翻译后修饰、构象变化、亚细胞定位或迁移、蛋白质间相互作用等,这些都无法在基因水平上找到答案。因此,要想真正揭开生命现象的奥秘,必须进行蛋白质水平的功能研究。在不同生理或病理状态下,筛选鉴定出某些已知或未知的蛋白质后,必须回答蛋白在生物体内的生物学功能到底是什么,是什么样的结构基础使得蛋白质分子能够发挥其特定生物学功能,其分子调控机制是怎样的等问题。传统的蛋白质功能研究习惯于将待研究的蛋白质进行提取分离和纯化,进而分析其化学结构和生物学活性,但很多情况下这样的研究方法无法揭示某种蛋白质在生物体内的功能,因为蛋白质的功能往往是通过与其他分子的特异相互作用而共同实现的,并非单独发挥作用的。近年来,蛋白质功能研究技术和方法已经得到迅速发展,大量文章都涉及某些蛋白质功能方面的研究,但是对蛋白质功能研究方法进行系统综述的文章非常少,因此,试图对目前蛋白质功能研究方法和技术及其最新研究进展进行综述。1-de与双荧光差异凝胶电泳蛋白质组学(proteome)目前被广泛应用于寻找大量新型生物标记物和药物治疗靶点,为阐明蛋白质功能、疾病机制及疾病治疗提供依据。研究蛋白质表达谱的技术路线主要有两条,一条是传统的基于凝胶电泳(gel-based)的蛋白质表达谱技术,如双向凝胶电泳(twodimensionalgelelectrophoresis,2-DE)、双向荧光差异凝胶电泳(twodimensionalfluorescencedifferencegelelectrophoresis,2D-DIGE)与质谱的联用技术。2-DE技术虽然传统而“古老”,但由于其高分辨率和高通量的特点,仍然是非常有效而且关键的蛋白质分离技术,特别是在比较蛋白质组学研究中。另一条是基于非胶体系的多维液相层析分离与生物质谱相结合的技术路线(MudPIT-LC-MS),其特点是高通量、速度快,克服了2-DE不能很好显示低丰度、疏水性、偏碱性、极大和极小蛋白的缺点。目前我国已建立了具有国际先进水平的、高通量、高灵敏的蛋白质组学研究技术平台,并且成功开展了有关人类重要生理及病理相关的蛋白质组学研究,如人胎肝的蛋白质表达谱和磷酸化修饰谱、肺癌和肝癌差异蛋白质组等研究。通过蛋白质组学方法筛选鉴定出来的差异蛋白结果只是初步的,所以当筛选鉴定出差异蛋白后,可从网上检索该蛋白的相关信息和文献,选取比较有意义的特定蛋白进行在细胞内mRNA表达水平、蛋白表达水平、蛋白质-蛋白质相互作用的验证,并开展更为精细的后续功能的分析。2生命活动基础机体细胞内每个蛋白质并不是独立发挥作用,通常与其他蛋白质相互作用形成较大复合体,在特定的时间和空间内行使特定的功能,构成各项生命活动的基础。目前,用于研究蛋白质间相互作用的方法非常多,包括酵母双杂交技术、串联亲和纯化技术、荧光共振能量转移技术、蛋白质芯片技术、噬菌体表面展示技术、表面胞质团共振技术、免疫共沉淀等等,作为一种好的蛋白质相互作用方法,应该具备两个条件:(1)特异性,能鉴定出与目的蛋白特异作用的蛋白;(2)能反映在生理状态下蛋白质的相互作用。2.1转录激活相关蛋白酵母双杂交系统(yeasttwo-hybridsystem,Y2H)是由Field和Song在1989年研究真核基因转录调控时首次发明,是一种在酵母中利用转录激活物的重组来鉴定蛋白质之间相互作用的方法,在蛋白质相互作用方面扮演着重要角色。真核生长转录因子具有两个不同的结构域:DNA结合结构域(DNA-bindingdomain)和转录激活结构域(transcription-activatingdomain),分别与诱饵蛋白及可能与诱饵蛋白相互作用的猎物蛋白相连,并共同转入酵母细胞。如果两个蛋白能够发生相互作用就能使转录因子原来分开的两部分结合,从而激活下游报告基因。通过检测报告基因的表达产物就可判断两种蛋白是否发生相互作用,如Wang等应用酵母双杂交技术发现人Polo样激酶1(PLK1)与人乳头瘤病毒5型(HVP-5)的E2蛋白是相互作用的。后来又有研究者在细菌和哺乳动物细胞中进行双杂交。双杂交系统是研究蛋白分子间两两相互作用的传统技术,其假阳性率和假阴性率比较高,所以必须与其他技术联用加以鉴定。2.2核心靶点的选择与钙调蛋白结合多肽和tev蛋白分离的分子串联亲和纯化(tandemaffinitypurification,TAP)是近些年来发展起来的新技术,与酵母双杂交系统不同,此方法可在生理条件下研究多种蛋白质复合物的相互作用,兼具融合蛋白亲和色谱法和免疫共沉淀两种生化方法的优点,通过两步特异性的亲和纯化可获得与目的蛋白结合的高纯度蛋白质复合物。该方法首先对目的蛋白进行TAP标签标记,标签包括3个部分:蛋白A、钙调素结合多肽(calmodulinbindingpeptide,CBP)和中间连接的TEV酶识别的酶切位点。在蛋白复合物的分离纯化中,第一步利用与蛋白标签具有亲和作用的色谱柱,采用TEV蛋白酶断裂TEV蛋白酶切位点的方式洗脱;第二步利用与钙调蛋白结合肽具有亲和作用的钙调蛋白色谱柱,将蛋白复合物和TEV蛋白酶分开,纯化出的蛋白复合物用凝胶电泳、质谱技术或Edman降解法进行鉴定。TAP技术的优点是利用酶切的方法进行洗脱,条件温和,不破坏复合物的结构,并且经两步洗脱,去除了杂蛋白的干扰,提高了蛋白质相互作用结果的可靠性、特异性,远远超越了酵母双杂交传统技术。2.3荧光标记法检测两蛋白质的相互作用荧光共振能量转移技术(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)的基本原理是处于激活状态的供体能在足够近的距离(小于10nm)将本身的荧光传递到受体上。因此,用荧光标记的蛋白质,可以通过荧光体的能量传递来检测两蛋白质的相互作用。此技术的优点是可以在生理条件下无损伤、动态地研究蛋白质的相互作用,同时还能检测蛋白质在细胞内的定位。但是,该方法受荧光发色基团空间距离的限制,只能用于研究分子量小于200kD的蛋白。目前随着计算机技术的发展,很多研究者运用计算分析和构建相互作用模型的方法来预测蛋白质相互作用,从而发现更多未发现有相互作用的蛋白,但这些发现的蛋白需要利用以上提到的方法进行鉴定。总之,用于研究蛋白质相互作用的方法很多,所有方法都各有千秋,但至今尚无十分理想的方法可以大规模获得蛋白质相互作用的数据,故相互作用图谱有赖于各种研究方法的综合分析。3亚细胞定位的实现蛋白质作为生命活动的直接执行者,其功能与亚细胞定位密切相关,有序分布和动态调控的蛋白质是保证生命个体实现其精细的生物功能的前提。特别是对于真核细胞来说,蛋白质位于不同的亚细胞部位,其所行使的功能也不同,或者说蛋白质表达部位发生错误就会失去预期的功能,从而对细胞乃至对整个机体产生影响。目前更是提出了定位组(1ocalizome)的概念来大规模研究蛋白质的亚细胞定位。观察蛋白质在细胞内的精确定位可以借助各种显微镜技术。激光扫描共聚焦显微镜(laserscanningconfocalmicroscope,LSCM)作为一种集激光、显微镜和计算机于一体的新型、高精度显微镜,是近十几年来发展起来的大型生物学分析仪器,与其他显微镜相比,其功能强大,能进行荧光定量测量、共焦图像分析、三维图像重建、活细胞动力学参数检测、胞间通讯研究等,可对所观察的蛋白质进行定量、定性、定位的监测,在整个细胞生物学研究领域有着广阔的应用前景。免疫电镜技术(immunoelectronmicroscopy,IEM)是当今生物医学领域的一项重要研究手段,集电子显微技术与免疫细胞化学技术于一体,能在细胞微细结构水平对抗原或抗体进行定位。目前研究蛋白质的亚细胞定位已具备了多种成熟的方法,如融合报告基因定位法、免疫电镜技术定位、免疫荧光定位和生物信息学预测定位等。也有研究者提出可通过相互作用蛋白的亚细胞定位来检测目的蛋白的定位,此种方法的关键在于选定可靠的,且与目的蛋白相互作用的蛋白。3.1gfp的荧光检测融合报告基因定位法是将目的蛋白基因与易于检测的报告基因进行融合,构建融合基因表达载体表达融合蛋白,然后借助于报告基因表达产物的特征来定位目的蛋白质的一项技术。目前,报告基因就其表达产物而言,以绿色荧光蛋白(GFP)应用最为广泛,因为绿色荧光蛋白的相对分子质量较小,发色基团性质稳定,在与其它蛋白质融合后发射荧光,同时不影响它所连接的蛋白质的结构和功能。利用这些特性结合显微镜技术(如激光扫描共聚焦显微镜),通过检测GFP发射的荧光就可测定目的蛋白在细胞中的准确定位。如Vartiainen等利用GFP和激光扫描共聚焦技术证实了血清应答因子(SRF)的共激活剂MAL的亚细胞定位是受核内肌动蛋白的调控,Varecha等也通过GFP标记技术分析了人细胞凋亡过程中凋亡蛋白核酸内切酶G、AIF和AMID的细胞内定位情况。3.2免疫电镜技术免疫电镜技术是在免疫组织化学技术(immunohistochemistry)的基础上发展起来的,它是利用抗原与抗体特异性结合的原理,在超微结构水平上定位、定性及半定量抗原的技术方法。该方法为精确定位各种抗原的存在部位、研究细胞结构与功能的关系及其在病理情况下所发生的变化提供了有效的手段。免疫电镜技术主要经历了铁蛋白标记技术、酶标记技术以及胶体金标记技术3个主要发展阶段。胶体金标记免疫电镜技术因其具有特异性强、灵敏性高、方法简便等优点成为目前应用最广的免疫电镜标记物,用于细胞表面和细胞内多种抗原的精确定位。将免疫细胞化学方法与电镜技术联用最大的优点就是体内定位系统,反映的是活体状态下目标蛋白质在细胞中的位置,是最直接、准确的定位方法。如Hashimoto等利用原位杂交和免疫电镜的研究证实人绒毛外滋养层细胞有过氧化物酶小体存在。但是,这种方法的先决条件是要求具备目标蛋白质的特异性的抗体,而这大部分蛋白质来说都是很难具备的条件。另外,免疫细胞化学方法实验周期长,效率低,技术依赖性强,难以实现高通量。4反向遗传技术遗传学手段大致可以分为“正向遗传学”(forwardgenetics)和“反向遗传学”(reversegenetics)两类。正向遗传学是分子遗传学家最初可使用的一种方法,是指通过生物个体或细胞基因组的自发突变或人工诱变,寻找相关的表型或效应改变,然后从这些特定效应变化的个体或细胞中找到对应的突变基因,并揭示其功能,例如遗传病基因的克隆。反向遗传学的原理正好相反,人们首先是改变某个特定的基因或蛋白质,然后再去寻找有关的表型或效应变化,如基因敲除(knockout)、RNA干扰(RNAinterference,RNAi)等,这些技术目前已经趋于成熟。基因敲除虽然是一种很有效的产生突变个体方法,但因其复杂而又费时,故不能被普遍接受。而自1998年Fire等发现RNA干扰现象以来,RNAi技术已被证实是一种特异、高效、经济的抑制基因表达的手段而受到极大的重视和欢迎。2001年,RNAi技术被成功应用于哺乳动物细胞,其应用前景更加诱人。研究者们可以利用这项技术对目标基因或蛋白质进行特异性表达沉默,通过观察其表达被抑制的细胞或者生物体的从形态到各项生理生化指标的变化,对该基因或蛋白质的功能及参与的信号网络进行研究。这比传统的基因敲除方法要简单而且方便得多,因此短短几年,就有了很多突破性的成果,其中研究得最多的是跟疾病相关的一些基因和蛋白,如Song等已经成功地利用RNAi技术治愈了试验鼠的暴发性肝炎,Qin等报道,用siRNA沉默HIV的重要受体——chemokinereceptor5(CCR5)有效阻断了HIV病毒对人外周血淋巴细胞的侵入。4.1磷酸腺苷作诱导沉降性因子RNA干扰是与靶基因序列同源的双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)所诱导的一种特异性的转录后基因沉默现象(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)。外源性或内源性的双链RNA进入细胞后,在三磷酸腺苷(ATP)依赖性RNA酶Ⅲ(Dicer,DCR)的作用下被切割成3′端有2个突出碱基的21~23nt长度的小分子干扰RNA(smallinterferenceRNA,siRNA);这些siRNA与RNAi特异性酶结合,形成RNA诱导沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC);而后RISC在siRNA反义链的指导下与siRNA同源靶mRNA相结合,RISC中的重要组成成分Ago2蛋白在近中点位置将其切割,随后靶mRNA被细胞内RNA酶降解,转录后的mRNA就不能翻译出相对应的蛋白,而RISC游离出来,寻找新的目标分子,从而达到抑制靶基因表达的作用,如图1所示。4.2病毒载体诱导rnaisiRNA的制备主要有5种方法,包括化学合成法、体外转录合成法、dsRNA法、siRNA表达载体和siRNA表达框架(表1)。从表1可以看出,要想建立长效基因沉默的细胞株进行功能缺失研究,只能采用siRNA表达载体方法,其它方法均为诱发瞬时基因沉默。siRNA表达载体方法是借助表达质粒或表达病毒载体在细胞内产生siRNA,使研究者无需直接操作RNA就可达到长期抑制靶基因表达的目的,且载体上的抗性标记有助于快速筛选出阳性克隆,这使得其将具有更为广阔的应用前景,其中用病毒载体介导RNAi近年来受到人们重点关注,利用病毒载体能解决质粒转染效率低、效果不稳定和某些类型细胞不能转染等问题,扩大了RNAi的应用范围。常见病毒载体有腺病毒(adenovirus)载体、逆转录病毒(retrovirus)载体、慢病毒(lentivirus)载体等。最近慢病毒载体因其独特的优势,逐渐成为表达载体中的大热,与其它表达载体相比,最大的优势是它们能同时感染分裂细胞和非分裂细胞,对干细胞和难转染细胞的研究,能解决转染效率低的问题。如Kim等利用慢病毒载体抑制了间质干细胞中的蛋白ICAT的表达,通过与ICAT过表达组的比较,证实ICAT参与组织基质细胞的增值和分化;Wiederschain等利用pLKO-Tet-OnshRNA慢病毒载体系统有效抑制了一系列癌细胞系中Bmi-1和Mel-18蛋白的表达;Huang利用慢病毒载体高效抑制了蛋白Smad4在SMMC-7721细胞中的表达,并探讨了Smad4在TGF-beta1诱导的SMMC-7721细胞增值和凋亡过程中的作用。这些都说明慢病毒载体是一个高效且快速的干扰系统,如果能筛选出长效稳定基因沉默的细胞株,可以进一步根据目的蛋白/目的基因或其家族的已知功能特性,通过干扰组与正常细胞组或蛋白过表达组的比较,开展各类细胞功能试验来鉴定目的蛋白的具体功能和调节机制,如细胞周期及细胞凋亡检测、细胞运动试验、细胞侵袭试验、细胞中各类酶的测定、相关基因的表达、各项生理生化指标变化检测等。5蛋白质结构预测生物信息学是通过实验手段认识蛋白质功能方法的补充,它是现代生命科学与信息科学、计算机科学、数学、统计学、物理学、化学等学科相互渗透而高度交叉形成的一门新兴前沿学科。应用生物信息学技术预测蛋白质结构和功能已成为后基因组时代的一项重要任务,它贯穿蛋白质功能研