梨火疫病菌的检测方法研究

梨火疫病菌的检测方法研究

梨火病毒症是由梨、苹果、山楂、火荆棘和其他植物引起的最毁灭性疾病之一。病菌能够侵染蔷薇科40余属的220多种植物。目前中国还没有梨火疫病的发生,但梨火疫病的人为和自然传播对中国构成了潜在威胁,尤其是相邻的日本国已经有梨火疫病的分布,该病害传入中国的风险将会很大。准确灵敏的检测技术是阻止该病害传入的有效手段。本研究利用梨火疫病菌的标准菌株,提取脂多糖作为免疫原,免疫家兔,制备了抗血清,利用间接免疫荧光染色技术和协同凝集技术对梨火疫病菌进行了检测。1材料和方法1.1菌株和样品参试菌株及样品见表1。1.2实验材料新西兰大耳兔,10孔免疫荧光专用玻片,普通载玻片,FITC标记的羊抗兔IgG(华美公司),缓冲甘油,荧光显微镜等。1.3梨火病菌脂多糖的提取选取梨火疫病菌(0056菌株),参照Klement等和Barton-Wills等的方法提取梨火疫病菌的脂多糖。常规免疫家兔,最后一次免疫后10d采血,分离抗血清。1.4免疫荧光染色技术1.4.1ml-1-lm-1所有参试菌株均用无菌水制成106CFU·mL-1;接种样品及健康枝条剪成5mm小段,每5g样品加10mL无菌水,4℃浸泡4h,吸取浸出液备用。1.4.2羊抗兔的培养取样品10μL,分别加到免疫荧光专用玻片的孔(直径5mm)中,热风吹干,玻片通过火焰固定。抗血清用PBS(0.01mol·L-1,pH7.4)稀释1000倍,取10μL加到相应的孔中。37℃保湿孵育30～60min。蒸馏水轻轻淋洗(避免用水直接冲洗样品),风干。加FITC标记的羊抗兔IgG(用0.01mol·L-1PBS稀释至0.1mg·mL-1),每孔10μL。37℃保湿孵育30～60min。淋洗,风干。加浮载液(缓冲甘油),盖玻片封片。荧光显微镜观察。记录并照相。1.5联合凝集技术1.5.1菌株及样品协同凝集菌株为金黄葡萄球菌Staphylococcusaureus(CowanⅠ菌株,中国科学院微生物所提供)。参试菌株及样品见表1。1.5.2沉淀菌体的制备将金黄葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CowanⅠ菌株接入LB液体培养基中,37℃震荡培养48h,离心,弃上清,0.01mol·L-1PBS缓冲液离心洗涤3次(5000g,10min)。沉淀菌体按照1/10(W/V)用相同缓冲液悬浮(浓度为5×109CFU·mL-1),加入叠氮化钠至0.02g·dL-1,4℃保存。取1只1.5mL离心管,加入1mL上述金黄葡萄球菌菌悬液和0.2mL制备的抗血清,37℃孵育1h,0.01mol·L-1PBS缓冲液离心洗涤3次(5000g,10min),悬浮于1mL同一缓冲液中,即为抗血清致敏的金黄葡萄球菌。1.5.3检测法在洁净的载玻片上滴加致敏的金黄葡萄球菌20μL,取待测菌悬液或样品浸出液20μL,用灭菌牙签小心混匀,3～5min后,肉眼和显微镜观察并记载。2结果2.1梨火抗病性菌的免疫荧光检测供试的梨火疫病菌所有菌株均呈阳性反应,其他菌株及健康梨树枝条浸出液均未发现阳性细胞(图1)。2.2间接免疫荧光染色利用制备的抗血清,对人工接种发病(接种后30d)样品(枯死部位、枯死部位下0～10cm)和健康梨枝条样品进行检测。结果表明:所有接种样品均呈现强烈阳性反应(图2-A,B,C),健康对照则未见发荧光的细菌细胞(图2-D)。未经稀释的样品(枯死部位下0～10cm)浸出液,由于菌体浓度过高,荧光细胞堆积重叠(图2-A),背景荧光过强,影响观察和照相,但不影响结果的判断。稀释10倍后,则见局部成团分布的发荧光的菌体(图2-B)。病枝枯死部位可能由于死亡崩解细菌较多,可发现大量发荧光的细菌残体(图2-C)。间接免疫荧光染色方法的灵敏度为5×102CFU·mL-1。枯死部位与枯死部位下0～10cm样品细菌含量相当,但枯死部位细菌细胞的死亡和破碎影响结果的判定。2.3梨火灾流行病原体的联合凝集检测2.3.1集颗粒大小++根据反应的强弱程度,作以下划分:液体透明,凝集颗粒粗大为“++++”,凝集颗粒较大为“+++”,凝集颗粒小为“++”;液体不透明,有凝集颗粒者为“+”,无凝集颗粒为“-”(图3)。2.3.2凝集反应结果将不同梨火疫病菌菌株用生理盐水分别配制5×108,5×107,5×106,5×105,5×104和5×103CFU·mL-1菌悬液,其他参试菌株配制5×108CFU·mL-1菌悬液,分别与致敏的金黄葡萄球菌进行协同凝集。结果表明,除梨火疫病菌发生强烈凝集外,其他参试菌株反应均为阴性。所有梨火疫病菌菌株在5×103CFU·mL-1时观察不到凝集现象,表明该方法可以专化性检测梨火疫病菌,灵敏度为5×104CFU·mL-1(表2)。人工接种和自然发病的梨火疫病样品,其细菌浓度可达到106CFU·mL-1以上,所以该方法可以用于口岸对表现症状的苗木进行检测。2.4枝条凝集反应人工接种发病的梨树枝条和健康枝条用生理盐水制样,制样方法见1.4.1。结果表明,除健康样品外,发病部位和枝条枯死部位以下不同距离的枝条均发生了明显的凝集反应。可能由于枝条中的某些物质的影响,凝集图式呈絮状,而非典型颗粒状(图4)。3免疫荧光检测本研究表明,利用梨火疫病菌脂多糖制备的抗血清所建立的间接免疫荧光染色法和协同凝集法检测梨火疫病菌,耗时短,专化性好,可在一个工作日内完成,适合口岸对该病菌的检测。间接免疫荧光染色法灵敏度较高(5×102CFU·mL-1),可对已经表现症状和无症状的样品进行检测,但所需设备较昂贵;协同凝集法虽然灵敏度较低(5×104CFU·mL-1),但操作简单,不需复杂设备,一般实验室均可进行,并且致敏的金黄葡萄球菌经冷冻干燥后长期保存,随时可以进行检测,对表现症状的样品是一种准确而简便的检测方法。该方法与其他血清学方法相比,具有更直观的效果(能够观察到菌体形态或菌体凝集状态),也是目前国际上检测梨火疫病菌的经典方法。研究结果还表明,梨火疫病发病枝条的枯死部位不是最理想的取样和检测部位,应当对病斑下0～10cm的部位取样与检测。Roberts曾报道,检测梨火疫病菌的免疫荧光染色技术与一些欧文氏菌有交叉反应,经饱和吸附后,对部分菌株的交叉反应可完全消除,部分菌株的交叉反应只能减弱而不能消除。本研究制备的抗血清不与其他细菌发生交叉反应。其原因可能是Robe