全基因组表达谱芯片筛选及表达规律研究

全基因组表达谱芯片筛选及表达规律研究

随着人们生活水平的提高和兔子大规模纺织技术的提高，兔子的需求。长毛兔是典型的毛用兔,其被毛洁白、松软、浓密,因此备受广大消费者的青睐。如何提高我国长毛兔被毛密度和品质以满足消费者的需求,是目前亟待解决的问题。前人研究发现了一些参与毛囊发育过程的候选基因,如KAP、BMP2、MMP2、μPAR、TGF、IGF-1、FGF5、Hox家族基因等,但是仍然有很多未知基因有待探索。新西兰白兔为肉用型家兔,其被毛为标准毛型,被毛密度较稀,毛纤维直径较粗且粗毛含量高;皖系长毛兔为毛用型家兔,其被毛为长毛型,被毛密度高,毛纤维直径较细。本研究以被毛结构和被毛密度差异较大的新西兰白兔和皖系长毛兔为实验材料,利用家兔全基因组表达谱芯片筛选与毛纤维生长发育相关的基因,随后以皖系长毛兔(毛用型)为实验材料,采用实时荧光定量RT-PCR法研究Wnt10b、SFRP2基因在皖系长毛兔中的表达规律,为后期研究控制毛纤维生长发育基因的功能奠定基础。1材料和方法1.1实验材料1.1.1实验示例1.1.2芯片家兔全基因组表达谱芯片购自Agilent公司,规格为4×44K。上海伯豪生物芯片公司协助完成基因芯片筛选差异基因实验。1.2实验方法1.2.1实时荧光定量pcr实验采用TRIZOL法分别提取皖系长毛兔和新西兰白兔的皮肤组织总RNA。抽提所得总RNA经电泳质检合格后使用RNeasyminikit和RNase-FreeDNaseSet纯化。分别将2个兔品种的4个RNA样本等量混合RNA池,并分成2份,一份用于芯片实验,一份用于实时荧光定量PCR初步验证实验。同样采用TRIZOL法分别提取来自安徽省农科院种兔场不同周龄皖系长毛兔体侧部和臀部的皮肤组织RNA,每个周龄2公2母共8个RNA样本,保存于-70℃冰箱,用于实时荧光定量PCR探究差异基因在皖系长毛兔中的表达规律,进一步验证芯片结果。1.2.2pcr实时荧光定量测试结果1.2.2.荧光定量引物设计及rt-pcr扩增采用SYBRGreen法进行实时荧光定量PCR试验以初步验证芯片结果的可靠性。上述另一份RNA利用FastQuantRTKit(WithgDNase)(北京天根生化科技有限公司)反转录合成cD-NA,根据NCBI中Wnt10b、Shh、SFRP2、GAPDH的基因序列,设计荧光定量引物(表1),引物由大连TaKaRa公司合成。RT-PCR反应体系(20μL):2×UltraSYBRMixture(WithROX)10μL,上游引物(ForwardPrimer)10μmol/L1μL,下游引物(ReversePrimer)10μmol/L1μL,双蒸水(RNase-FreeWater)7μL,cDNA模板1μL,每个样本设置3个重复。RT-PCR反应程序:95℃预变性10min;95℃变性20s,58℃退火/延伸30s,72℃25s,40个循环;95℃1min,55℃30s,95℃20s。1.2.2.dna反转录合成利用FastQuantRTKit(WithgDNase)(北京天根生化科技有限公司)将上述皖系长毛兔各个周龄体侧部和臀部的RNA反转录合成cDNA。Wnt10b、SFRP2、GAPDH基因引物序列、试验方法同1.2.2.1。1.3荧光定量pcr数据处理实时荧光定量PCR数据分析,先用MiscrosoftExcel初步处理Wnt10b、Shh、SFRP2基因的实时荧光定量PCR数据,相对定量的结果采用-ΔΔCt算法进行处理:ΔΔCt=(待测组目的基因平均Ct值-待测组管家基因平均Ct值)-(对照组目的基因平均Ct-对照组管家基因平均Ct值)。然后用SPSS软件One-WayANOVA进行方差分析,用最小显著极差法(LSD)进行多重比较。Wnt10b、SFRP2基因相对表达量结果均以平均值±标准差表示。2结果2.1测定浓度的测定用1.5%琼脂糖凝胶检测总RNA的完整性,核酸蛋白测定仪测定浓度,稀释至100ng/μL,-70℃保存备用。由图1可知,提取的RNA28S、18S条带清晰,无明显降解,其OD260/OD280在1.7左右,纯度较高。2.2谱芯片的结果SAS分析发现在这714个差异基因中,Wnt10b、Shh、SFRP2基因与毛纤维生长发育相关(表3)。2.3荧光定量pcr检验发现光谱芯片的结果2.3.1fpr2基因在皮肤组织中的表达表达谱芯片结果发现,Wnt10b、Shh基因在皖系长毛兔皮肤组织中的表达量显著高于新西兰白兔皮肤组织;SFPR2基因在皖系长毛兔皮肤组织中的表达量显著低于新西兰白兔皮肤组织。选择Wnt10b、Shh、SFPR23个基因进行实时荧光定量PCR验证表达谱芯片结果,结果发现,2个实验所得基因表达量的差异倍数基本一致,而且基因的上调、下调趋势也是相同的(表4,图2),因此表达谱芯片筛选与毛纤维生长发育相关基因的结果是可靠的。2.3.2遗传因素的上下段2.3.2.周龄表达量探究Wnt10b基因在皖系长毛兔臀部和体侧部的表达规律,均以0周龄皖系长毛兔臀部的表达量为内对照,不同周龄公母兔臀部和体侧部Wnt10b基因的相对表达量变化见图3和图4。Wnt10b基因在皖系长毛兔公、母兔的不同部位的相对表达量波动趋势基本一致,均在0周龄表达量相对较低,除了母兔体侧部在0周龄时表达量最低,其余均在16周龄表达量最低。Wnt10b基因在皖系长毛兔公兔臀部相对表达量变化:0~2周龄时显著上升,2~4周龄时显著下降,4~6周龄时显著上升,6~8周龄时相对表达量较为稳定,8~10周龄时显著下降,10~14周龄时显著上升,14~16周龄显著下降,16~18周龄显著上升,18~22周龄呈下降趋势(图3)。Wnt10b基因在皖系长毛兔母兔臀部相对表达量变化:0~2周龄时显著上升,2~4周龄时显著下降,4~8周龄时相对表达量较为稳定,8~10周龄时显著下降,10~14周龄时相对表达量较为稳定,14~16周龄显著下降,16~18周龄显著上升,18~22周龄呈下降趋势(图3)。Wnt10b基因在皖系长毛兔公兔体侧部相对表达量变化:0~2周龄时显著上升,2~4周龄小幅度下降,4~8周龄时相对表达量较为稳定,8~16周龄时显著下降,16~18周龄显著上升,18~22周龄呈下降趋势(图5)。Wnt10b基因在皖系长毛兔母兔体侧部相对表达量变化:0~2周龄时显著上升,2~4周龄显著下降,4~8周龄时显著上升,8~16周龄时显著下降,16~22周龄呈下降趋势(图5)。2.3.2.wnt10b基因6、14周龄皖系长毛兔公兔臀部SFRP2基因相对表达量与其他周龄之间差异显著(P<0.05),其他周龄之间均差异不显著(P>0.05)(图5)。皖系长毛兔母兔臀部4周龄时SFRP2基因相对表达量显著高于其他周龄中SFRP2基因相对表达量(P<0.05)(图5)。SFRP2基因在皖系长毛兔公体侧部相对表达量变化:0~2周龄小幅度下降,2~4周龄显著上升,4~12周龄波动幅度较为平稳,12~14周龄显著下降,14~18周龄显著上升,18~20周龄显著下降,20~22周龄小幅度上升(图6)。SFRP2基因在皖系长毛兔母兔体侧部相对表达量变化:0~2周龄小幅度下降,2~4周龄显著上升,4~12周龄周龄波动幅度较为平稳,12~18周龄显著上升,18~20周龄显著下降,20~22周龄显著上升(图6)。据研究表明,参与毛囊形态发生及生长的信号通路主要有Wnt、Hedgehog、Notch信号通路。Ou等证实,Wnt10b基因通过激活Wnt/β-catenin途径,使细胞质内积累β-catenin,从而调节毛囊的发育。张坤等发现,Wnt10b在小鼠毛囊生长早期就开始表达,生长中期表达量最高,生长晚期表达量相对降低,Wnt10b可能参与毛囊生长发育的过程。本研究中,0~2周龄时是幼兔毛生长的旺盛期,因此Wnt10b基因相对表达量显著上升。家兔在30日龄时进入第1次换毛期,因此2~4周龄时Wnt10b基因相对表达量显著下降,16周龄Wnt10b基因相对表达量显著低于其他周龄是因为此时家兔第1次换毛基本结束。家兔在130日龄时进入第2次换毛期,因此18周龄时Wnt10b基因相对表达量显著高于16周龄。表明Wnt10b基因在皖系长毛兔毛生长周期中起到一定的调节作用,能够通过诱发毛囊的再生而促进毛的生长发育。这与刘维等研究结果一致,Wnt10b在绒山羊皮肤组织中呈现规律性表达,在绒山羊毛囊发育旺盛期表达量较高,毛囊发育退行期和休止期表达量较低,说明Wnt10b可能参与毛囊的生长和周期维持。本研究中,SFRP2基因相对表达量0~2周龄小幅度下降,2~4周龄小幅度上升,说明SFRP2基因在皖系长毛兔毛生长旺盛期表达量相对较低,在毛生长结束期表达量相对较高,此变化趋势与Wnt10b基因相对表达量变化趋势相反,与表达谱芯片结果中Wnt10b基因为上调基因和SFRP2基因为下调基因的结果相符。这符合赵玉凤等的研究结果,SFPR2是Wnt信号通路中的抑制基因,SFRPs蛋白质与Wnt信号传导通路中的Fz受体的结构较为相似,这类蛋白可以通过竞争性抑制代替Fz受体与Wnt蛋白结合,从而抑制Wnt蛋白质的功能,阻断Wnt通路。4国家兔毛生长周期基因表达分析本研究发现Wnt10b、Shh、SFRP2基因与家兔毛纤维生长发育有关,采用荧光定量PCR初步验证结果与芯片结果一致。采用荧光定量PCR探究Wnt10b、SFRP2基因在皖系长毛兔不同周龄中的表达规律,进一步验证了Wnt10b基因在皖系长毛兔毛生长周期中起到一定的调节作用,能够通过诱发毛囊的再生而促进毛的生长发育;SFRP2基因在皖系长毛兔毛生长旺盛期表达量相对较低,在毛生长结束期表达量相对较高,因此SFRP2基因在皖系长毛兔毛生长周期中起到抑制毛生长的作用。本研究中,一部分是用于芯片实验和实时荧光定量RT-PCR初步验证样本,采自江苏省金陵种兔场的皖系长毛兔和新西兰白兔的皮肤组织样。每个品种分别选择健康公母兔各2只,饲养于同一条件下,于3月龄时分别采其体侧部和臀部皮肤2g左右。另一部分是用于实时荧光定量RT-PCR分析差异基因表达规律的实验样本,采自安徽省农科院种兔场的皖系长毛兔的皮肤组织样,对母兔同期配种,在相同的饲养管理条件下饲养,分别在0、2、4、6、8、10、1