中国番茄细菌性溃疡病发生和控制研究

中国番茄细菌性溃疡病发生和控制研究

细菌病是番茄生产中的一种毁灭性疾病之一。它分布在世界主要番茄产区，产量可达80%以上。我国北京、黑龙江、辽宁、内蒙、新疆、河北、山西、山东和上海等地都有番茄细菌性溃疡病发生的报道。该病病原菌为密执安棒形杆菌密执安亚种(Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis,以下简称Cmm),是我国检疫性有害生物,我国1997年将其列入《中国进境植物检疫潜在的植物危险性病、虫、杂草(三类有害生物)名录》。虽然国际上报道活化酯(acibenzolar-S-methyl)等药剂可以诱导番茄抗溃疡病,铜制剂如可杀得等保护性杀菌剂应用于生产中预防溃疡病,但目前世界范围内尚无理想的防治该病害的有效药剂。培育抗病品种是防治番茄溃疡病潜在的最有效方法之一,已经证实野生番茄种中具有对溃疡病表现一定抗性或耐病性的种质材料,但国际上目前还没有商品化的抗病品种。我国番茄种植面积大,分布区域广,主栽品种或品系多,遗传背景相对复杂,但关于该病害的研究基础十分薄弱,局限于病原菌初步鉴定。近年来该病害在我国发生危害加剧,对种子繁育和大田生产构成直接威胁。基于应对外来生物入侵和预防、控制该病害的需要,作者所在单位和美国Campbell公司开展了包括病害快速检测、抗病种质资源筛选和综合控制技术在内的“中国番茄细菌性溃疡病发生和控制研究”合作项目。建立稳定的致病体系是筛选抗病种质资源和进行药剂控制技术研究的前提。国内外已报道的常用于植物细菌性病害的传统接种方法有浸根法、剪叶法和针刺法等,各具优点和局限性。根据番茄栽培中后期打顶整枝、打枝促控和提高产量的做法,作者在现有方法基础上设计和实践了番茄细菌性溃疡病苗期打顶接种新方法。本文介绍了相关研究和检测结果。1材料和方法1.1育苗基质的制备番茄品种包括佳粉10、合作908和华南红宝石,分别由北京蔬菜研究中心、上海番茄研究所和广东农科院蔬菜研究所培育,系我国华北、江南与华南地区的番茄主栽品种。育苗基质按番茄生产田土壤∶草炭∶蛭石为1∶1∶1(v∶v∶v)配制,经160℃干热灭菌5h,冷却后装入72穴(6行×12列)育苗盘中作为苗床;番茄种子播种前先在无菌水中浸泡24h,吸胀后播种,每穴2～3粒,在温室中(夜间最低温度控制在15～18℃,白天平均气温为26℃左右,最高温度为32～35℃;相对湿度控制在30%～60%,日平均相对湿度为42%,下同)育苗;播种后7～10d间苗,每穴选留长势均匀健壮的1株幼苗培育至2～3片真叶期供接种用。1.2供试菌株及培养基配方番茄细菌性溃疡病菌:美国菌株Cmm-09由美国Campbell公司研究中心提供;中国菌株Cmm-BX由中国农科院植物保护研究所提供。以上供试菌均在YDC培养基上培养72h后[YDC培养基配方(1000mL):10g酵母提取物、20gCaCO3超微粉(Sigma,No.C-6763)、20g葡萄糖、15g琼脂(配制时葡萄糖应与其它成分分开灭菌,待培养基冷却至50℃左右时再加入,混匀后倒平板备用)],按照麦法兰(McFarland)云度计比浊法,用0.85%无菌生理盐水配制成试验设计所需浓度的菌悬液备用。1.3田间病情调查接种时期选择播种后培育21～28d的2～3片真叶期番茄幼苗。接种浓度:Cmm-09和Cmm-BX均为108、109cfu/mL两个浓度;以无菌生理盐水为空白对照(简称CK)。接种方法包括打顶接种新方法和3种传统接种方法。1)打顶法:将14cm手术剪(型号:PTJ-3)的前端1cm蘸取菌悬液后在番茄幼苗子叶上部1～2cm处将主茎剪断;2)剪叶法:用蘸有菌悬液的手术剪(规格型号同上)从番茄幼苗叶柄基部剪去第一真叶;3)针刺法:用蘸有菌悬液的接种针将番茄幼苗子叶与第一真叶之间的茎部致伤;4)浸根法:将番茄幼苗从秧床上轻轻拔起后用水洗掉根部泥土,将根尖端剪去2cm左右后,将幼苗的根系在菌悬液中浸泡30min,然后栽种到灭菌育苗基质苗床上。每个处理设4个重复,每个重复为6株苗。接种幼苗在1.1中所述温室中培养,适时浇水保证秧床土壤湿润。接种后21d,调查并记录番茄细菌性溃疡病苗期发病情况,病情分级标准参考Poysa的方法略作改动:0级,不出现叶片(或子叶)萎蔫或茎坏死;1级,叶片(或子叶)轻度变黄或萎蔫;2级,叶片(或子叶)中度萎蔫或茎轻度坏死;3级,叶片(或子叶)严重萎蔫或茎严重坏死;4级,植株死亡。依照下列公式计算病情指数。调查数据应用SAS软件进行新复极差分析,评价打顶接种方法与传统接种方法之间及同种方法6个不同处理之间在3个供试品种上病株率和病情指数的差异显著性。病株率(DP)=(病株数/接种株数)×100病情指数(DI)=[Σ(病级数值×该病级株数)×100]/(病级最高值×调查株数)1.4菌株的重新分离和检测1.4.1菌株的制备选取打顶法接种中各处理的显症植株3株,分别剪取病苗1～2cm茎段,置于灭菌后的培养皿内加1～2滴无菌水,挤压出茎部组织液,用接种环蘸取组织液在ISTA推荐的Cmm选择性培养基mSCM平板上划线[mSCM培养基配制:将2.62gK2HPO4·3H2O、0.5gMgSO4·7H2O、1.5g硼酸、10g甘露糖、0.1g酵母提取物、15g琼脂溶于980mL蒸馏水中,灭菌后加入100mg烟酸(溶于20mL无菌水)、30mg萘啶酮酸钠盐(溶于1mL0.1mol/LNaOH)、200mg放线菌酮(溶于1mL无水甲醇)],25～28℃下培养7～14d,挑取中部具有小黑点的浅黄色单菌落,在YDC培养基平板上纯化。1.4.2发病植株检测使用美国Agdia公司提供的检测Cmm专用的基于免疫凝聚原理的试剂盒ImmunoStrip,对发病植株进行检测,以是否出现阳性反应检测线作为判断依据。1.4.3cmm5-gcgafigctacaca按照Dreier等报道的番茄细菌性溃疡病菌一对特异性引物Cmm5、Cmm6(引物序列:Cmm5为5′-GCGAATAAGCCCATATCAA-3′;Cmm6为5′-CGTCAGGAGGTCGCTA-ATA-3′),对上述1.4.1中分离物的菌悬液直接进行PCR扩增,在琼脂糖凝胶上电泳,经溴化乙锭染色后在紫外灯下观测是否得到特异性扩增产物。2结果与分析2.1菌株鉴定结果接种7d后观测,打顶法及3种传统接种方法的所有接种处理的番茄幼苗均未显现明显溃疡病症状;接种14d后,Cmm-09和Cmm-BX处理的个别植株表现出轻度的子叶萎蔫;21d后发现供试3个品种上接种美国Cmm-09菌株109、108cfu/mL和国内Cmm-BX菌株109、108cfu/mL的4个处理中所有幼苗均出现不同程度的子叶萎蔫、茎坏死或植株死亡等典型细菌性溃疡病症状(图1)。病株率稳定在87.5%以上,其中接种Cmm-BX的植株病情指数最低为43.75,最高达82.29,接种Cmm-09的植株病情指数在23.96～57.29之间;而无菌生理盐水空白对照处理的病情指数为0,仅有极少数幼苗子叶出现生理变黄或萎蔫,其余均长势良好,90%以上植株均从子叶的叶腋处生长出新枝。各处理21d后,植株病情指数见表1。2.23种抗病品种的病情比较接种后21d观察,用剪叶法接种,3个供试品种中用Cmm-BX处理的部分植株出现叶片轻度萎蔫症状,病株率低于41.7%,病情指数均在20以下,多数植株长势良好,未见明显溃疡病症状。用针刺法接种,3个供试品种中用Cmm-BX处理的部分植株出现叶片轻度萎蔫症状,除华南红宝石的病株率超过50%,病情指数在20以上外,其余2个品种的病株率均在12.5%以下,病情指数在10以下,与对照相比,无显著差异,多数植株长势良好,未见明显溃疡病症状。用浸根法接种,在3个供试品种中,6个处理的个别植株叶片呈现不规律的轻度萎蔫症状,但病株率均在20%以下,植株的病情指数在10以下,与对照相比无显著差异,90%以上的植株长势大体良好,未见典型溃疡病症状。2.3菌株鉴定及样品测定选择性培养基mSCM分离显症植株表明,从打顶法接种Cmm-09(108)、Cmm-09(109)、Cmm-BX(109)和Cmm-BX(108)4个处理的病株上能够再次分离获得培养性状与Cmm一致的菌落,经纯化后的分离物在YDC培养基上呈黄色粘稠状菌落。而从无菌生理盐水接种处理的幼苗上未能分离获得培养性状与Cmm相似的菌落。ImmunoStrip检测结果表明,打顶法接种Cmm-09(108)、Cmm-09(109)、Cmm-BX(109)和Cmm-BX(108)4个处理中的病株及Cmm菌株能够使ImmunoStrip呈阳性反应,CK处理呈阴性反应(图2)。用特异性引物对从打顶法接种Cmm-09(108)、Cmm-09(109)、Cmm-BX(109)和Cmm-BX(108)4个处理的病株上获得分离物的菌悬液直接进行PCR扩增,扩增产物经染色和电泳后,可见到特异性的614bp扩增片段(图3)。3接种方法的选择本试验中供试的番茄细菌性溃疡病菌2个菌株分别来自美国和中国,3个供试品种分别为中国华北、江南和华南的主栽番茄品种,保证了试验结果具有代表性。基于致病效果观测、免疫凝聚试剂盒及PCR检测,证明了打顶接种新方法在番茄细菌性溃疡病苗期接种上的科学性和简便易行性,为番茄抗细菌性溃疡病性状鉴定和病菌的致病性测定等相关研究提供了可供借鉴的技术支持。浸根法作为细菌病害的常用接种方法,在本试验中发病结果未呈现出规律性,且病情指数较小,不适合作为番茄苗期抗细菌性溃疡病鉴定的接种方法。浸根法接种后,试验中出现的Cmm-09菌株低浓度接种体的病情指数略高于高浓度接种体,可能是由于操作误差及环境条件引起,经方差分析,无显著性差异,属正常误差范围,若增大样本容量,这种误差是可以避免的。剪叶法与针刺法接种后,多数植株均未表现出溃疡病典型症状,可能与这2种方法的接菌量较小有关,同样不适合用于番茄苗期抗细菌性溃疡病鉴定。与传统接种方法相比,打顶法操作简单,接种时手术剪与植株的接触面积大,接菌量大小可通过调节菌悬液浓度来加以控制,显症时间相对较短,植株在接种14～21d后即表现出典型的溃疡病症状。试验中用无菌生理盐水接种的空白对照也有极少数植株出现生理性的子叶变黄或萎蔫,这是由于幼苗此时已在温室中生长了40～50d,部分长势较快的幼苗受营养、水份等环境条件所限,表现出的正常生理现象,但此现象不同于番茄溃疡病菌侵染所致症状,ImmunoStrip和PCR的检测结果也很好地验证了这