8个兔品种微卫星遗传多样性分析

8个兔品种微卫星遗传多样性分析

微卫星是近年来发展起来的新型dna分子标记。这些dna序列是由少量氨基酸（通常1.6）组成的多个序列重复的。被认为是遗传因素之一。自联合国粮农组织将微卫星标记作为优先推荐的分析工具以来,各国学者也开始利用微卫星对部分家兔的遗传多样性进行了分析。Caon等利用微卫星标记分析了欧洲当地肉牛品种的遗传多样性。JoonghoShin等研究了人类表皮生长因子受体(EGFR)基因3’端非编码区1个A碱基的缺失突变,引起该区微卫星的不稳定,提高了该基因mRNA的稳定性,引起EGFR基因过度表达,导致人类肿瘤的发生。李慧芳等利用微卫星DNA多态性分析了中国地方鸭品种的分子遗传多样性。黄生强等利用微卫星标记预测了猪部分经济性状的杂种优势。然而,在微卫星分子标记广泛使用的同时,在分子标记检测中通常会因为各种原因而导致其结果存在一定比例的误差,比如样品质量、Marker大小、引物与模板DNA分子间的互补以及人为因素等等。笔者选取18个微卫星标记,为减少等位基因判读的错误,采用PCR扩增结合荧光标记全自动电泳检测技术检测微卫星长度多态性,以期准确揭示这8个兔品种的遗传多样性,为家兔种质资源的有效保护和合理利用提供理论依据。1荧光标记pcr扩增随机采取具备品种特征的皖系长毛兔209只、比利时兔105只、美系獭兔104只、九疑山兔72只、新西兰白兔52只、闽西南黑兔48只、苏系长毛兔48只和福建黄兔48只,耳缘静脉抽取3ml血样,肝素钠抗凝,于-20℃下冷冻保存,备用。家兔血液基因组DNA的提取方法,参照《分子克隆实验指南》(第3版)并稍加改进。从28对微卫星引物中筛选了多态性较好的18对引物。对每对引物上游引物5’端分别用FAM、HEX或TAMRA3种荧光染料进行标记,引物避光保存。根据微卫星扩增片段大小的范围和引物荧光标记颜色的差异,对筛选出的18对引物进行组合试验,依据是每3种颜色荧光为一组,该组内荧光PCR扩增产物片段的大小相差50bp以上,这样的组合共有6个。所用引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司(Sangon)合成。18对荧光标记微卫星引物组合情况以及PCR反应条件如表1所示。PCR反应体系(20μl):10×PCR(不含Mg2+)Buffer2μl,25mmol/LMgCl20.8～1.5μl,2.5mmol/LdNTP1μl,10μmol/L上下游引物各1μl,TaqDNA聚合酶1.0U,100ng/μlDNA模板1μl,ddH2O补齐20μl。加样过程在冰浴中进行,由于荧光引物见光分解,故所有操作均要在避光条件下进行,分装管事先用锡箔纸包好,PCR扩增在96孔板中进行。PCR反应程序:95℃预变性5min,94℃变性45s,52～64℃退火45s,72℃延伸45s,30个循环;最后72℃延伸10min,4℃避光保存。PCR扩增产物先在2.0%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测,然后送交上海INVETROGEN公司使用ABI-3730XLDNAAnalyzer全自动测序仪进行检测。利用Microsatellite-Toolkit软件计算各微卫星座位的等位基因频率、多态信息含量、期望杂合度,通过Dispan软件计算各品种间的标准遗传距离(Ds),并采用PHYLIP软件对所研究的群体进行聚类分析。2品种间遗传距离聚类分析利用GeneMapper4.0软件确定各个基因座位等位基因的大小,所有等位基因的大小介于90～356bp,图1为其中2对引物的毛细管凝胶电泳结果。8个兔品种18个微卫星座位上的多态信息含量(PIC)和基因期望杂合度(H)见表2。由表2可知,18个微卫星座位反映的8个兔品种多态信息含量(PIC)介于0.0625～0.8740,各个微卫星座位的多态信息含量(PIC)在不同兔品种间的变异程度有较大差异:美系獭兔在D6Utr4位点PIC含量最高,为0.8740;而苏系长毛兔在19L1G5位点PIC含量最低,为0.0625。18个微卫星座位反映的8个兔品种平均基因期望杂合度(H)也存在较大差异:在6L1F10位点上,新西兰白兔H值为0.6426,而闽西南黑兔H值仅为0.2807,同一位点不同品种间相差较大。另外,平均基因期望杂合度(H)比平均杂合度明显较高,表明品种内可能存在一定程度的近交。8个兔品种平均多态信息含量由低到高的次序与平均基因期望杂合度的次序基本一致,依次为:苏系长毛兔(SX)、闽西南黑兔(MB)、皖系长毛兔(WX)、九疑山兔(JM)、新西兰白兔(NZ)、比利时兔(BR)、美系獭兔(RR)和福建黄兔(FY)。根据Nei’s法计算DS遗传距离(表3),可以看出8个兔品种之间的遗传距离为0.0936～0.3506。通过群体间遗传距离分析得到的聚类图能够更直观地表现群体间关系。系统进化树把8个家兔品种体分为3大类:苏系长毛兔、皖系长毛兔、美系獭兔、九疑山兔和闽西南黑兔聚为第1类群,新西兰白兔和福建黄兔聚为第2类群,比利时兔为第3类群(图2)。3不同品种兔的遗传多样性多态信息含量(PIC)是衡量基因片段多态性较好的指标。该研究中的18个微卫星座位反映的8个家兔品种平均多态信息含量(PIC)为0.4185～0.5488,与黄邓萍等的研究结果不一致,可能是由于所采用的家兔品种、微卫星引物对数以及试验方法等不同所造成的。在8个家兔品种中,福建黄兔的平均多态信息含量最高,为0.5488,属于高度多态;苏系长毛兔的平均多态信息含量最低,为0.4185,属于中度多态。该试验结果表明,在这8个家兔品种中福建黄兔可提供的遗传信息比其他7个兔品种相对要高,这很可能与其所处的地理位置和培育历史有关。福建黄兔是由福州地区农民长期自繁自养形成的,后来因受到外来大型品种兔的冲击,仅在边远山区存在少量纯种,最终由福建省农业科学院畜牧兽医研究所通过群体继代选育得以保存下来的地方品种。苏系长毛兔的遗传多样性在这8个家兔品种中最低,这可能由于该研究中采集的该品种的样本数偏少,产生了遗传漂变;另外也可能与样本来源兔场的选育程度有关。该研究的苏系长毛兔样本取自江苏省农业科学院苏系长毛兔小群保种群体,该小群保种体系经过较多世代的封闭选育,加之群体数量较小,群体基因型渐渐趋于一致,遗传多态信息含量有可能降低。在同一个微卫星座位不同兔品种间的多态信息含量差异较大。在Sol08位点上,比利时兔PIC含量最低,为0.4226;而美系獭兔PIC含量最高,为0.7166,差异非常明显。同一兔品种不同微卫星座位上多态信息含量存在差异。例如,福建黄兔在Sol33位点PIC为0.2599,呈低度多态性;而在Sat7位点PIC为0.6982,呈高度多态性。这可能是由于选取的等位基因在各个群体中的分布不均所致,也可能是由于该兔品种在长期的选育过程中不同微卫星座位所受选择压的差异所造成的。该研究结果表明,该8个家兔品种的遗传多样性较为丰富。基因杂合度,也称为基因多样度,平均基因杂合度的大小近似地反映出遗传结构变异程度的高低。18个微卫星座位反映的8个家兔品种平均基因杂合度(H)为0.4758～0.6036,说明这8个家兔品种具有较高的遗传多样性。该研究中我国地方家兔品种福建黄兔平均基因杂合度为0.6036,略低于谢喜平等报道的福建黄兔平均基因杂合度(0.6766),其原因可能是各自所采用样品数、微卫星标记以及PCR检测方法等方面的不同所造成的。微卫星大部分属于非结构基因序列,它的变异几乎不受选择的影响,从而在进化过程中其变异就可在群体内大量积累。遗传距离反映了研究群体的系统进化,用以描述群体的遗传结构和品种间的差异。一般认为,群体分化时间越短,遗传距离越小。群体间遗传距离是遗传变异的尺度。该研究结果表明,苏系长毛兔与皖系长毛兔,九疑山兔与闽西南黑兔先聚成一小类,再与美系獭兔聚成第1类群;新西兰白兔与福建黄兔聚成第2类群;比利时兔独自成为第3类群。该结果与这些兔品种的经济类型和地理分布等存在一定程度上的关联。苏系长毛兔、皖系长毛兔为毛用兔,美系獭兔为皮用兔品种,这3种兔品种聚为一小类,与孙红梅等利用微卫星分析所得结果一致。3个兔品种都属于皮用或毛用兔品种,在品种的选育过程中这3个家兔品种均主要以选择被毛品种为重点,另一方面为了提高生产性能,大量引进了外来兔品种,苏系长毛兔和皖系长毛兔均含有德系长毛兔的血统,导致了它们在检测结果上的相似性,从而产生此聚类结果;九疑山兔与闽西南黑兔都是由我国山地农民长期自养自繁而形成的地方品种。从地理位置上来看,二者都是起源于南方山陵地区,气候地理条件相似,而且在体型上都为中小型兔品种,将二者归为一类,与中国地方家兔品种的地理分布相吻合,表现出明显的生态区域性;新西兰白兔与福建黄兔聚为一类,究其原因:(1)新西兰白兔为肉用兔品种,福建黄兔近年来的选育重点亦为肉用;(2)福建黄兔在20世纪曾受到大型外来兔品种的冲击,后来经选育得以保存,因此新西兰白兔与福建黄兔在遗传距离上较为接近;比利时兔单独形成一大类,比利时兔是英国