分子病理学技术讲稿

临床病理技术

------免疫与分子病理技术首都医科大学临床病理中心冯骥良

器官病理学细胞病理学超微病理学免疫病理学分子病理学远程病理学大体细胞超微结构分子基因病理学的进步是病理技术的进步病理学技术包括：

传统病理学技术和现代新技术

人体病理学技术和实验病理学技术

一免疫组织化学与免疫细胞化学原理与方法

免疫组织与细胞化学（Immunohistochemistryandimmunocytochemistry）：

是在单克隆抗体技术产生后，利用免疫学原理，将抗原抗体反应应用与组织细胞化学而进一步通过级连放大，增加敏感性。最后用辣根过氧化物酶显色。从而定位组织细胞中抗原（蛋白多肽、酶）等多种基因产物的特异方法。在病理学外检工作中可用于对不同来源，HE难以诊断的的肿瘤进行确诊和鉴别诊断。

基本原理：形成“抗原－抗体复合物”。图1：CK19阳性的BEL-7402细胞

图2：OV-6阳性的HepG2细胞肌动蛋白雄激素受体CD3-T细胞雌激素受体（ER）免疫组织化学技术的主要步骤：

1．提取抗原(免疫原Immunogen);2．用免疫原免疫动物(兔)制备抗血清(多克隆抗体)或免疫动物(鼠)后，用杂交瘤技术制备单克隆抗体；3．纯化抗体；4．抗体标记组织切片；5．染色反应；6．观察结果。常用的抗体标记物：1．酶为最常用的标记物。作为标记的酶应具有以下条件：①底物是特异性的，且易于显示；②酶反应产物稳定，不易扩散；③容易获得纯酶分子且较稳定；④酶标记抗体后，不影响两者的活性；⑤被检组织中不应存在内源性相同的酶或其底物。常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）、硷性磷酸酶（AKP）、葡萄糖氧化酶（GOD）等。2．荧光素指在高能量光波的激发下能产生荧光的物质。常用的有异硫氰酸荧光素（FITC）、四甲基异硫氰酸罗达明（TRITC）。3．生物素其与卵白素的亲和力明显高于抗原抗体的结合力。4．金属标记物如铁蛋白和胶体金。多用于免疫电镜。三．常用免疫组织化学染色方法（一）直接法将荧光素(免疫荧光法)或酶直接标记在第一抗体上，以检查相应的抗原。直接法具有特异性强的优点，但敏感性差，耗费抗体多。（二）间接法先用荧光素或酶标记第二抗体，一抗为特异性抗体，二抗仅有种族特异性。特点:⑴预先标好二抗，较方便；⑵比直接法敏感，但仍差。（三）PAP法与双PAP法：既过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法(PerixidaseAntiperoxidaseComplexMethod,PAP)先将过氧化物酶（HRP）免疫兔/羊/鼠，制成兔/羊/鼠抗ＨＲＰ；然后再与ＨＲＰ结合，形成一个稳定的多角形结构（PAP）。特点：⑴敏感性较高；⑵背景染色低（相对）；⑶双PAP敏感性更高，但背景相对较重。（四）ABC法：既卵白素－生物素过氧化物酶复合物法(AvidinBiotin-peroxidaseComplex,ABC)利用卵白素与生物素特有的高度亲和力，先将生物素与酶结合形成生物素化HRP，再以生物素化HRP与卵白素按一定比例混合，形成一个复合物；同时先将二抗生物素化。１．如将卵白素换成链霉亲和素，则为：ＳＡＢＣ法：(StreptAvidinBiotin-peroxidaseComplex)２．将链霉亲和素和生物素先连结起来，则称：ＬＳＡＢ法：labelledStreptAvidin-Biotin３．用链霉素抗生物素蛋白连结辣根过氧化物酶，则为：Ｓ－Ｐ法：(StreptAvidinPeroxidaseconjugataedmethod)若用碱性磷酸酶标记链霉卵白素则称ＳＡＰ法。若分别用碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，则称ＤＳ法特点:⑴敏感性高，（比ＰＡＰ高８～４０倍）；⑵背景淡，链霉亲和素更好；⑶方法较简便，时间较短；⑷应用范围广，也可用于原位杂交和免疫电镜。

四．免疫组织化学染色过程中需注意的有关事项

１．正确设置免疫组织化学的对照

对照原则：首先对照第一抗体；替代对照要注意相同的原则；阳性结果阴性对照，阴性结果阳性对照；染色清晰，定位准确。阴性对照：（１）空白对照：用ＰＢＳ置换第一抗体；（２）血清替代对照：用同种动物的正常血清代替第一抗体；阳性对照：用已知或已被实验证明为阳性的组织；自身对照：利用组织切片内的各种不同的组织成分作对照。2．假阳性反应：⑴非特异性反应：边缘现象、皱折和刀痕、出血和坏死等；⑵内源性过氧化物酶：红细胞、炎细胞、退变坏死细胞和某些腺上皮分泌物，以及某些富含过氧化物酶的组织，如脑、肝等；⑶抗体的交叉反应：抗体本身含有与人体组织发生交叉反应的成分；⑷试剂浓度过高或失效。3．假阴性反应：

⑴组织固定不当或固定时间过长；⑵抗体效价过低或久置失效；⑶组织中抗原被粘稠基质或分泌物阻隔；⑷DAB或H2O2的浓度不当。五、免疫组织化学在肿瘤诊断和鉴别诊断中的应用

（一）在肿瘤诊断中应用免疫组织化学染色的原因：１在常规病理活检中,通常有５～１０％的疑难病例不能明确诊断。２形态结构相似的肿瘤可为不同的组织来源（如未分化癌和恶性淋巴瘤）因而难于识别，给治疗带来困难。３一些转移性肿瘤常常缺乏特有的组织学特征，因而无法确定其原发病灶（如甲状腺癌和前列腺癌）。４通过一些反映细胞增殖和与肿瘤恶性程度有关的标记物协助识别肿瘤的良恶性。（二）各种不同组织及其肿瘤常见的标记物：

1．上皮组织及其肿瘤标记物：（１）存在于所有上皮细胞内的标记物：细胞角蛋白（Cytokeratin,ＣＫ）：一种中间丝蛋白（２）存在于大部分上皮细胞内的标记物：①角蛋白多肽（如ＣＫ１９）；②上皮细胞膜抗原（epithelialmembraneantigen,ＥＭＡ）。（３）选择性存在于某些上皮细胞内的标记物：①癌胚抗原（ＣＥＡ）；②甲胎蛋白（ＡＦＰ）；③前列腺特异性抗原（ＰＳＡ）及激素类等。2．间叶组织（软组织）及其肿瘤标记物：

（１）间叶源性肿瘤：波形蛋白（Vimentin）；（２）纤维组织源性肿瘤：纤维瘤、肉瘤，恶纤组。①抗胰蛋白酶（α1—ＡＴ，ＡＡＴ）；②抗胰糜蛋白酶（α—ＡＣＴ，ＡＣＴ）；③溶菌酶（Lysozyme）。3．肌细胞及肌上皮肿瘤及其标记物：肌瘤、肌肉瘤、肌上皮瘤。⑴结蛋白（Desmin），最常用，肌细胞分化最早的标记；⑵肌动蛋白（Actin），属肌丝蛋白，６种亚型分别存在于不同的肌细胞、肌上皮细胞⑶肌球蛋白（Myosin），属肌丝蛋白，分Ⅰ型（慢）和Ⅱ型（快）收缩纤维，存在于心肌、横纹肌及平滑肌中，肌动蛋白和肌球蛋白均出现在肌细胞发育分化中期。⑷肌红蛋白（Myoglobin），是心肌和横纹肌结合氧的肌红蛋白，存在于分化成熟的横纹肌中。４．内皮细胞肿瘤及其标记物：血管内皮肉瘤⑴第Ⅷ因子相关抗原（FactorⅧ-relatedAntigen,Ｆ８）⑵荆豆凝集素（UlexEuropaeus－1Lectin,ＵＥＡ－１）；⑶ＢＭＡ２００、ＣＤ３１、ＣＤ３４等。５．骨、软骨和脂肪组织肿瘤及其标记物：

⑴Ｓ－１００，Vimentin阳性；⑵Lysozyme少数阳性。６．滑膜及间皮肿瘤及其标记物：双向分化，无特异性标记物。Keratin,EMA;Vimentin,FN,AAT,ACT,Lysozyme等均有可能阳性。７．周围神经肿瘤及其标记物：

⑴S-100：神经纤维肿瘤，神经鞘肿瘤。⑵髓性碱性蛋白（Myelinbasicprotein,MBA）；⑶髓鞘相关蛋白（MAG）；⑷层粘连蛋白（Laminin）。8．淋巴造血组织肿瘤及其标记物：(１)LCA（LeucocyteCommonAntigen，白细胞共同抗原）；(２)CD19，CD25，CD20－－标记Ｂ淋巴细胞；(３)CD4，CD8，CD3－－标记Ｔ淋巴细胞；(４)ＭＡＣ３８７、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ－－标记组织细胞；(５)ＣＤ１５、ＣＤ３０（Ki-antigen）－－标记Ｒ－Ｓ细胞；(６)CD11，CD14－－标记单核细胞、粒细胞。9．神经及神经内分泌肿瘤及其标记物：（１）胶质纤维酸性蛋白（Glialfibrillaryacidicprotein,ＧＦＡＰ）：胶质细胞、室管膜细胞；（２）髓鞘碱性蛋白（ＭＢＰ）：少突胶质细胞；（３）神经细胞烯醇化酶（Neurunspecificenolosa,ＮＳＥ）：神经细胞；（４）神经微丝（Neurofilaments,ＮＦ）神经细胞、嗜铬细胞、副节细胞、ＡＰＵＤ瘤；（５）嗜铬素Ａ（ChromograninＡ）：神经内分泌肿瘤。（６）其它：ＡＣＴＨ、Calcitotin、Gastrin、Glucagon、hGH、Insulin、Serotonin等。免疫组织化学最突出的优点：能在原位确定组织及细胞结构的化学成分。深入---------原位分子杂交和免疫电镜。电子显微镜技术电子显微镜（electronmicrosocope）简称电镜，是以电子束为照明源，通过电子流对生物样品的透射以及电磁透镜的多级放大后的荧光屏上成像的大型精密仪器。按工作原理和用途的不同可分为透射式电镜（transmissionelectronmicroscope,TEM）和扫描式电镜（scanningelectronmicroscope,SEM）二种基本类型。图白藜芦醇处理Jurkat细胞超微结构

一．透射式电镜

主要用于观察细胞内部的微细结构，由于电子的穿透力较弱，故用于透射电镜观察的标本必须切成50~100nm的超薄切片。换句话说，一个细胞要被切成100~200个薄片才适于在透射电镜下观察。样品在被超薄切片之前，一般要经过固定、脱水和包埋等处理，在切片之后还要经过染色等处理才能进行观察。超薄切片术（techniquesofultrathinsection）是最基本的电镜样品制备技术，其基本过程同石蜡切片大体相似，包括取材、固定、漂洗、脱水、渗透与聚合、切片和染色等多个环节，但操作过程比石蜡切片更为细致与复杂。为了获得理想的超薄切片，操作者必须认真对待每一步骤，任何环节的疏忽都可能导致制样的失败。合格的超薄切片样品应该达到以下基本要求：（1）切片的厚度应在50nm左右，不能超过100nm，以获得较高的分辨率和较高的反差；（2）切片应能耐受电子束的强烈照射而不发生破裂、变形；（3）细胞超微结构保持良好，没有明显的物质凝聚和丢失。电子显微镜技术：细胞内的细胞器、细胞骨架或大分子水平的变化。细胞内的病毒颗粒等。

肿瘤鉴别诊断病毒包涵体肾炎的分型

二．扫描电镜

扫描电子显微镜就是用聚得很细的电子束流照射要检测的样品表面。由于电子束与样品的相互作用产生各种信息然后通过不同的检测器接收相应的信息，经过处理后显示出样品的各种特征。

扫描电镜具有以下特点：能够直接观察样品的表面的结构；样品制备过程简单，不用切成超薄切片；可以从各种角度对样品进行观察；景深大，图像富有立体感；图像的放大范围广，分辨率也比较高；电子束对样品的损伤与污染程度较小；在观察形貌的同时，还可利用从样品发出的其他信号作微区成分分析。扫描电镜：血管破裂扫描电镜：小肠微绒毛第五节生物芯片技术

生物芯片技术（biochiptechnology）是将大量具有生物识别功能的分子或生物样品有序地点阵排列在支持物上并与标记的检体分子同时反应或杂交，通过放射自显影、荧光扫描、化学发光或酶标显示可获得大量有用的生物信息的新技术。生物芯片技术包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片、以及元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片。可对DNA、RNA、多肽、蛋白质、细胞、组织以及其它生物成分进行高效快捷的测试和分析。一、基因芯片基因芯片(genechip)是指采用原位合成或显微打印方法，将大量DNA探针固化于支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效地检测。可自动、快速地检测出成千上万个基因的表达情况，为基因诊断、药物筛选以及新基因发现提供了有力的手段。图基因芯片

二、蛋白芯片

蛋白芯片技术的基本原理是将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片，然后，用标记了特定荧光素的蛋白质或其他成分与芯片作用，经漂将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去，再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫可描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系，由此达到检测多种蛋白质及其功能的目的。如抗体芯片可排列数百种单克隆抗体，通过这张芯片，人们在一次实验中就能够比较几百种蛋白的表达变化。对于诊断疾病：如传染病、肿瘤、遗传病等临床工作以及信号传导、细胞周期调控、细胞结构、细胞凋亡和神经生物学等基础研究都具有广泛的应用前景