第7章微生物遗传

第七章微生物的遗传与变异第一节基本概念1、遗传（Heredity）生物体上一代将自己的一整套遗传因子传给下一代，从而保证子代和亲代相似的行为和功能，具极其稳定的特性。2、遗传因子（Heredityfactor）即基因，能表达和产生基因产物的DNA序列，对少数RNA病毒为RNA序列。3、遗传型（基因型，Genotype）一个生物个体所具有的一整套基因。1）结构基因：关于蛋白质的氨基酸组成信息；2）调节基因：基因的选择性表达信息。4、表型（Phenotype）指某一生物体所据有的一切外表特征及内在特征的总和，是遗传型在合适环境下的具体表现，是一种现实性（可见）。遗传型＋环境条件代谢发育表型5、变异（Variation）指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质在结构和数量上的改变，即遗传型的改变。1）染色体数目改变n→2n（同源多倍体）2）染色体结构改变（染色体畸变）①缺失②添加③倒位④易位3）基因突变（点突变）染色体碱基发生改变ⅰ)碱基置换a转换b巅换ⅱ)移码突变a缺失（1~2个）b添加（1~2个）6、饰变（Modification）指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、翻译水平上的表型变化。7、饰变与变异的比较①几率：饰变高，变异低；②性状改变幅度：饰变小；变异大；③可遗传性：饰变不可；变异可；④回复性：饰变高，变异低。各种基因突变的碱基变化示意图一三个经典实验第二节遗传变异的物质基础（一）肺炎链球菌转化试验1、Griffith的转化试验（1928年）分别用降解DNA、RNA、蛋白质的酶作用于有毒的S型菌细胞抽提物只有DNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性DNA是转化所必需的转化因子上图结论：

只有DNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性→

DNA是转化所必需的转化因子。这些实验说明，加热杀死的S型细菌，在其细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞，并使R型细胞获得稳定的遗传性状。2、Avery的证实实验（1944年）同时，还进行了体内实验，S-DNA加R型菌注射小鼠，结果小鼠死。证实：细菌的转化因子是DNA。1、用含32P-DNA的phage侵染细菌（二）T2噬菌体感染实验（1952年）2、用含35S-Pr的phage侵染细菌证明：DNA包含了合成Pr外壳的遗传信息。后用纯DNA感染细菌的转化试验证明DNA是phage遗传变异的物质基础。（三）TMV的重建实验结论：上面的三个实验，得出一个共同的结论：只有核酸才是负荷遗传信息的物质基础。在RNA病毒中，遗传物质也是核酸，只不过是RNA。二遗传物质在微生物细胞中的存在方式1、细胞水平1）原核微生物①细菌：球菌1个核区，杆菌2个核区；②放线菌：菌丝细胞多个核区，孢子单个核区。2）真核微生物①酵母菌：单核；②真菌：菌丝多核，孢子单核。2、细胞核水平1）原核微生物①无核膜的裸露分子，一般不与蛋白质结合；②质粒。2）真核微生物①有核膜，DNA与组蛋白结合形成真正的染色体；②叶绿体、线粒体、中心体。3、染色体水平1）原核微生物2）真核微生物单倍体；1个染色体大多单倍体，少数有多倍体；多个染色体4、核酸水平1）原核微生物DNA含量占80％，RNA＋Pr占20％。2）真核微生物DNA含量占27％，RNA占6％，Pr占66％。5、基因水平1）原核微生物由操纵子和调节基因组成调控系统2）真核微生物①存在内元（内含子）、外元（外显子）；②有细胞器基因。6、密码子水平7、核苷酸水平三原核生物的质粒是细胞质中独立于核基因组外，具有独立复制的小型共价闭合环状DNA（CCCDNA）。细菌质粒的3种不同构型椰毒假单胞菌（Pseudomonascocovenenans）的拟核染色体（A，B）和质粒（B，箭头所指）

可分：

高考倍数质粒(highcopynumber)：每个细胞中有10～100个，与染色体的复制不同步——松弛型质粒(relaxedplasmid)。

低考倍数质粒(lowcopynumber)：每个细胞中有1～2个，与染色体的复制同步——严紧型质粒(stringentplasmid)。窄宿主范围质粒(narrowhostrangeplasmid)：只能在一种特定的宿主细胞中复制。

广宿主范围质粒(broadhostrangeplasmid)：可以在多种宿主细胞中复制。

1、F质粒（致育因子Fertilityfactor，

F因子，性因子）

是决定性别并有转移能力的质粒，约100kb。

F因子能以游离状态(F+)和以与染色体相结合的状态(Hfr)存在于细胞中，所以又称之为附加体(episome)。携带F质粒的菌株称为F+菌株（相当于雄性），无F质粒的菌株称为F-菌株（相当于雌性）。2、抗药性质粒（Resistantplasmid，抗性因子Resistancefactor，R因子）

携带有分解某种抗生素或药物酶系的基因的质粒，可以赋予宿主细胞耐或抗或分解或失活某种抗生素或药物的性能。

包括抗药性和抗重金属二大类。抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。3、大肠杆菌素质粒（Colplasmid，Col因子）

携带有产生大肠杆菌素（colicin）酶系基因的质粒，赋予大肠杆菌产生大肠杆菌素的能力。

细菌素一般根据产生菌的种类进行命名：由G+细菌产生的细菌素或与细菌素类似的因子与colicins有所不同，但通常也是由质粒基因编码，有些甚至有商业价值，例如一种乳酸细菌产生的细菌素NisinA能强烈抑制某些G+细菌的生长，而被用于食品工业的保藏。4、诱癌（致瘤性）质粒

(Tumorinducingplasmid)，毒性质粒（Virulenceplasmid）

许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因，其产物对宿主（动物、植物）造成伤害。

根癌土壤杆菌所含Ti质粒是引起双子叶植物冠瘿瘤的致病因子1）Ti质粒

苏云金杆菌含有编码δ内毒素(伴孢晶体中)的质粒2）Sym质粒

是某些快生型根瘤菌细胞中存在的携带有某种可以识别、侵染相应豆科植物根系与之形成共生根瘤的基因的质粒。

5、降解质粒携带有分解或降解某种芳香族化合物为简单化合物或无机物的酶系基因的质粒，赋予宿主细胞降解某种芳香族化合物的能力。

将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式，环境保护方面具有重要的意义。一

基因突变（Genemutatiom）

第三节

基因突变和诱变育种

是变异的一类，泛指细胞内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化可自发或诱发产生。

自发突变：环境因素的影响，DNA复制过程的偶然错误等而导致，一般频率较低，通常为10-6-10-9。

诱变：某些物理、化学因素对生物体的DNA进行直接作用，突变以较高的频率产生。

突变率（Mutationrate）:每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。

突变率也可用每一单位群体在每一世代中产生突变株的数目来表示。eg:突变率为10-8，即指该细胞在一亿次分裂中会发生一次突变。

eg:突变率为10-8，一个含108个细胞的群体分裂成2×108时平均发生一次突变的突变几率。

1、营养缺陷型（auxotroph）一种缺乏合成其生存所必须的营养物的突变型，只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物才能生长。（一）可选择突变株

1）特点

负选择标记

不能合成某种或几种生长因子，在选择培养基（一般为基本培养基）上不生长。

2）表示方法

①

基因型：所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示；

②表型：同上，但第一个字母大写，且不用斜体。

在具体使用时多用hisC-和hisC+，分别表示缺陷型和野生型

影印平板（Replicaplating）法是Lederberg夫妇在1952年建立2、抗药性突变型（resistantmutant）1）特点2）表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”表示指野生型菌株因发生基因突变后，而产生对某种化学药物或致死物理因子的抗性变异类型。

正选择标记突变株可直接从抗性平板上获得-----在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。3、条件致死突变型（conditionallethalmutant）指突变后，在某一条件下可正常生长、繁殖并呈现固有的表型，而在另一种条件下却无法生长、繁殖的突变类型。

特点：负选择标记这类突变型常被用来分离生长繁殖必需的突变基因（二）不可选择性突变型

1、形态突变型（Morphologicalmutant）

指由突变引起的细胞个体或菌落形态的变异。

特点：非选择性突变

突变株和野生型菌株均可生长，但可从形态特征上进行区分。

eg:有鞭毛→无鞭毛，细胞壁脱落或缺失等。

产蛋白酶缺陷突变株的筛选菌落颜色变化β半乳糖苷酶基因的插入失活，使重组子菌落为白色而与兰色的非重组子分开。2、抗原突变型（Antigenicmutant）

指由于基因突变引起的细胞抗原结构发生改变的突变类型。

特点：非选择性突变

3、产量突变型（Metabolitequantitativemutant）

指引基因突变而产生的代谢产物产量明显有别于原始菌株的突变类型。

特点：非选择性突变

二基因突变的特点1、不对应性指突变的发生与环境因子（如，物理、化学、生物等因子）没有对应性。或突变的形状与引起突变的原因无直接的对应关系。2、自发性各种性状的突变，可以在没有人为诱变因素下自发发生。

1）变量实验（fluctuationanalysis）SalvadorLuriaandMaxDelbruck（1943），1969获诺贝尔生理和医学奖

SalvadorLuriaMaxDelbruck2）Newcombe的涂布实验（1949）

3）影印实验（replicaplating）J．Lederberg1958年获诺贝尔生理和医学奖。

JoshuaLederberg3、稀有性自发突变的频率是较低和稳定的，一般在10-6~10-9间。

4、独立性某一基因的突变既不提高，也不降低其它任何基因的突变。彼此独立，互不干扰。5、诱变性通过诱变剂的作用，可提高自发突变的频率，一般可提高10~105

倍。不论是自发突变或诱变突变得到的突变型，它们间并无本质上的差别，诱变剂仅起到提高突变率的作用。

6、稳定性7、可逆性三基因突变的机制

（一）诱变

1、碱基置换

1）碱基类似物

间接引起

e.g.:5-溴尿嘧啶（5-Bu）

2）亚硝酸

直接引起

氧化脱氨基作用，使C→U、A→H（次黄嘌呤）、G→X（黄嘌呤）。

3）羟胺（NH4OH）

4）烷化剂（如硫酸二乙酯C2H5O-SO2-OC2H5）不可逆改变

2、移码突变（Frame(Phase)-shiftmutation）

指诱变剂使DNA分子中的一个或几个核苷酸的增添或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和翻译错误的突变。

诱变剂（嵌入剂）：

①

吖啶类染料：吖啶橙、吖啶黄、溴化乙锭（EB）；

②

ICR类：烷化剂与吖啶类结合。

若干诱变剂的作用机制及诱变功能3、染色体畸变（

chromosomalaberration）

某些因子如

X射线等的辐射和烷化剂、亚硝酸等，引起DNA的大损伤，即染色体畸变，不仅可发生染色体拷贝数的变化，而且更重要的是导致染色体结构上的缺失、重复、插入、易位、倒位等事件。

1）X射线

①

DNA骨架断裂；

②

TT同链二聚体；

③

原菌体中水与氧结合成H2O2；

④

刺激细胞产生碱基类似物→引起诱变。

2）转座因子

是生物体自身带有的可跳动的DNA序列，可从一个染色体或质粒跳到另一染色体或质粒，甚至从一个细胞到另一细胞。

1940年McClintock在研究玉米粒斑点变异的遗传研究时发现。

①插入序列（InsertionSequences，IS）剪贴式转座②转座子（Transposons，Tn）

是能够插入染色体或质粒不同位点的一段

DNA序列，大小2～25kb，具有转座功能。能在染色体上和质粒的许多位点上插入并改换位点，因此也称跳跃基因（jumpinggenes），0.7~1.7kb。

复制转座

转座子两末端的DNA碱基序列为反向重复序列。转座子上携带有编码某些细菌表型特征的基因，如抗卡那霉素和新霉素的基因，且本身也可自我复制。

a复合型Tn（含IS）：中间为抗药基因

bTn3族（不含IS）：中间为转座酶基因和抗药基因，两端反向重复。

③

转座（诱变）噬菌体

Mu噬菌体：37kb，有反向重复，可随意插到宿主DNA任何位置，引起基因突变

（二）自发突变

1、背景辐射和环境诱变

2、自身有害代谢物诱变

3、DNA复制过程中碱基错配

自发脱氨C→U，互变异构。

四

诱变育种

1、诱变育种基本环节

2、诱变育种中考虑的几个原则

1）选择简便而高效的诱变剂

①

紫外线20s～10min；

②

NTG（N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍）。

2）处理单细胞悬液

①

使诱变剂与细胞充分接触；

②

避免长出不纯菌落，尽量选单核细胞。

表型延迟：这种基因型虽已突变，但表型却要经染色体复制、分离和细胞分裂后才表现出来的现象。

球菌选指数期营养细胞，杆菌选芽胞，酵母菌选指数期营养细胞，放线菌和真菌选孢子。

3）选择合适的诱变剂量

4）充分利用复合处理的协同效应

5）利用和创造形态、生理与产量间的相关指标

6）其它（见书）

3、营养缺陷型的筛选

［－］基本培养基：仅能满足某微生物野生型菌株生长需要的最低成分的组合培养基。

［＋］完全培养基：能满足某微生物的全部的营养缺陷型生长的天然的或半组合培养基。

［A］或［B］补充培养基：仅能满足某一微生物的某一营养缺陷型生长的组合或半组合培养基。

有关的三种培养基

有关的三类遗传型

野生型：指从自然界中分离到的未发生营养缺陷型突变的原始菌株，可在上三种培养基中生长。

营养缺陷型：野生型菌株经诱变后由于丧失了某种酶的合成能力而只能在加有该酶合成产物的培养基上生长。

原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或基因重组后产生的在营养要求上和野生型相同的菌株。

1、诱变剂处理

2、淘汰野生型

1）抗生素法

①

青霉素法

适用于细菌，杀死正常生长的野生型（抑制细胞壁合成），浓缩处于休止的营养缺陷型

②

制霉菌素法

适用于酵母菌、霉菌、真菌，与细胞壁上的甾醇作用，从而使细胞膜损伤（只作用于生长着的细胞），浓缩缺陷型。

2）菌丝过滤法

适用于放线菌、霉菌，将野生型和缺陷型菌株的孢子接种于［－］上，野生型孢子萌发成菌丝，过滤，数次后浓缩缺陷型。

3、检出缺陷型

1）影印培养

2）夹层培养

3）限量补充法

4）逐个检出法

4、鉴定缺陷型

生长普法：指在混有供试菌的平板表面点加微量营养物，视其营养物周围有否长菌来确定该供试菌的营养要求的一种快速直观的方法。

1）用无菌水洗涤离心营养缺陷型，除去培养基，配成107～108个/ml浓度的悬液；

2）取0.1ml与［—］培养基摇匀后注入培养皿，凝固干燥后，在皿背面划几个区域；

3）在培养皿中按区加营养粉末；

4）经培养后，如发现某一营养物周围有生长圈，就说明此菌就是该营养物的营养缺陷型突变株。

第四节

基因重组和杂交育种

一

基因重组是杂交育种的理论基础

1、基因重组（Generecombination）

把两个不同形状个体内的遗传基因转移在一起，重新组合形成新的遗传型个体的方式。

2、方式

1）高等动植物：只有通过有性生殖；2）真菌：

有性生殖、准性生殖；

3）细菌：

转化、接合、转导、原生质体融合；

4）人工技术：

基因工程。

二

原核生物的基因重组

（一）转化（Transformation）

受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换把它整合到自己的基因组中，从而获得部分新的遗传性状的现象。

感受态细胞（competentcell）：具有摄取外源DNA能力的细胞。

自然感受态：细胞在一定生长阶段出现的生理特性，受细菌自身的基因控制。

人工感受态：通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内。

1、自然遗传转化（Naturalgenetictransformation）

1）进行自然转化，需要二方面必要的条件

①

建立了感受态的受体细胞；

②

外源游离DNA分子。

2）转化过程

3）特点

①

转化发生在完整DNA双链分子和一个ssDNA片段之间；

②

不接触，不需要活的DNA供体细胞；

③

转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化（DNA）供体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系；

④

通常情况下质粒的自然转化效率要低得多。

2、人工转化（Artificialtransformation）

在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。

常用的人工转化手段：用CaCl2处理细胞，电穿孔等。

3、转染(Transfection)把噬菌体或其他病毒的DNA/RNA抽提出来，让它去感染感受态的宿主细胞，并进而产生正常噬菌体或病毒后代的现象。

与转化的不同：

是病毒或噬菌体，并非遗传的供体菌；

中间也不发生任何遗传因子的交换或整合；

最后也不产生具有杂种性质的转化子。（二）转导（Transduction）

通过缺陷型噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA

片断携带到受体细胞中，通过交换整合使后者获得前者部分遗传性状的现象。

1、普遍性转导（Generalizedtransduction）

转导噬菌体：能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体。

普遍性转导三种后果流产转导完全转导外源DNA被降解，转导失败1）完全普遍转导（Completetransduction）

2)流产转导（Abortivetransduction）

2、局限性转导（Specialized（Restricted）transduction）

通过某些部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组形成转导子的现象。

1）低频转导

用不正常切离（10-4～10-6）形成的λdgal或λdbio感染受体菌（gal－或bio－），整合后形成能稳定遗传的局限转导子。

2）高频转导

缺陷噬菌体（λdgal）和正常噬菌体（λE）同时感染受体菌，形成双重溶源菌，被诱导正常切离，形成50％λdgal和50％λE