乳腺癌组织切片免疫组织化学染色的方法

乳腺癌组织切片免疫组织化学染色的方法

目前，用于免疫组织化学染色等抗生剂的方法和试剂种类繁多，尤其是用于检测雌激素（er）和激素（pd）。因送检组织经甲醛固定后抗原决定族被醛基交联封闭,无法有效地与抗体结合而显示出来。国内已有许多同行对用于显示石蜡切片上ER、PR的方法和试剂进行了探讨,结果都在一定程度上提高了检测ER、PR的阳性率和染色强度。我们长期用微波进行抗原修复,因多种原因引致结果不稳定,如组织固定是否及时,用于抗原修复的试剂的酸碱度,微波的强度和作用时间的长短、温度、抗体的质量、抗体和显色系统的搭配等等诸多因素都影响检测的结果,为了提高检测ER、PR的阳性率,现将我们采用高压水浴法,用0.01ml/L枸橼酸钠缓冲液为抗原修复液,对乳腺癌的组织切片上的ER、PR进行检测的方法介绍如下。1材料和方法1.1实验动物及试剂本科室近期已确诊为乳腺癌并已用微波抗原修复及常规免疫组化方法检测为阳性的ER(+)、PR(+)和弱阳性ER(±)、PR(±)及阴性的组织蜡块各10例(共30例),切片厚度4μm。试剂:第一抗体为兔抗人雌激素受体(ER)单克隆抗体;兔抗人孕激素受体(PR)单克隆抗体(均为浓缩型:用时1∶50的浓度稀释),快捷免疫组化MaxVisionTM检测试剂盒(即用型:单抗兔KIT5006)(以上试剂均购于福州迈新生物技术开有限公司)。枸橼酸钠缓冲液(0.01ml/L)pH6.0。仪器:电磁炉1900W,不锈钢高压锅(直径20cm),立式塑料染色缸。1.2免疫组化染色组织切片经常规脱蜡至水,3%过氧化氢,用微波低档处理1min,抑制内源性过氧化物酶,蒸馏水洗1min,放置盛有0.01ml/L枸橼酸钠缓冲液的立式塑料染色缸内,再将染色缸放入高压锅内,将锅内加入自来水,水位要在染色缸的下三分之一至二分之一处为宜,盖上锅盖,然后将高压锅放置通电的电磁炉上,首先将电磁炉调到高档,待锅内水沸腾至高压锅盖顶的出气口喷气后,盖上压力阀,看到压力阀不停跳动喷气时,将电磁炉调到中档,以保持高压锅内恒定的压力和温度,这样也不会使锅内的水沸腾得太猛将染色缸冲倒。同时,将电磁炉的定时间按钮调到8min。待8min后,将高压锅移到工作台上,让高压锅自然降温,降压,取下压力阀,打开锅盖,将盛有组织切片的染色缸取出,放在冷水盆中,使其冷却约至室温后,再进行免疫组化染色。免疫组化染色的过程,我们采用二步法,它不含生物素,可以避免由于生物素引起的非特性背景显色,所以无需正常血清封闭内源性生物素。我们将经抗原修复后的切片,PBS洗3次各3min,油笔画圈后可直接滴加第一抗体,37℃1h,PBS洗3次各3min,滴加第二抗体,37℃20min,PBS洗3次各3min,DAB显色约1min～2min,复染,封片。2免疫组化检测我们将30例乳腺癌组织块分成三组,分别各用上述高压水浴法与微波抗原修复法进行免疫组化检测对比,其组织切片上的ER、PR结果显示这三组切片上的ER、PR阳性率均显示本法有明显提高,染色增强,见表1。3枸杞酸钠缓冲液的制备和修复方法的选择在整个免疫组化染色过程中需经过许多环节,每个环节都可影响到免疫组化检测结果。因送检组织细胞内的蛋白质被醛基交联,导致抗原决定族被封闭,不能与抗体有效地结合。所以只要破坏醛基交联,使抗原决定族充分暴露才能和抗体有效地结合。用于检测乳腺癌组织切片上的ER、PR的抗原修复方法很多。我们为提高检测ER、PR阳性率,参考杂志上国内许多同行探讨、摸索出的种种方法进行实验,其阳性率都有一定程度提高,但有时不稳定,有些方法所用试剂,如盐酸抗原修复法,有刺鼻的气味,其阳性率性提高不明显。又如硫酸铅钾作为抗原修复液,不易配制,液体乳白色混浊,其沉淀物易沉淀于组织切片上,易将DAB吸收,使切片的非特异染色背影加深。EDTA价格较贵。而我们选用的枸橼酸钠是每个免疫组化室最常用的一种缓冲液,许多试验都要用到的,它价格便宜,易配制,透明、无色、无味、无毒,不会影响实验结果,对人体无害,不污染环境,重要的是在本方法中可提高ER、PR检测的阳性率和染色强度。我们认为它是一种良好的抗原修复液。方法方面,有的方法繁琐,不易掌握,耗时过长,需4℃过夜。有的方法,如煮沸法,需用电炉,有一定的不安全性,高压煮沸法,最大的缺点是易脱片,其试剂用量大。王力的高压锅水浴防脱片法,其加热时间太短,对抗原修复的温度尚未达到。我们用其方法在实验过程中测得温度只达到80℃,未达到修复抗原的最佳温度(95℃～98℃),而且需要4℃过夜。我们经过对每种方法所用的试剂、时间、温度、试剂的pH值等都进行实验对比,其结果各不相同。最后我们参考了王力的高压水浴修复组织抗原防脱片法,对乳腺癌组织切片上的ER、PR的检测。本方法采用电磁炉,其优点是,无明火,较安全,易调节和掌握煮沸的时间和温度。在抗原修复的过程中,我们对煮沸所需时间和温度进行了测试和对比,在压力阀喷气时开始记时,2min后,取下压力阀打开锅盖,马上测量修复液的温度,只达到80℃,同样方法测5min时测量其温度为91℃。当我们将修复时间调整为8min时,测量温度为98℃已达到抗原修复的最佳温度。在抗原修复液的选择方面,我们用0.01ml/L枸橼酸钠与EDTA做了对比,结果阳性率都有明显提高,但显色强度则枸橼酸钠比EDTA强。另外能提高检测ER、PR阳性率的重要一个方面,是抗体的选择,我们选用兔抗人的单克隆抗体,二抗选用迈新生物技术开发公司的即用型快捷免疫组化MaxVisionTM检测试剂盒(KIT5006),为单抗兔的二抗,它能有效地与第一抗体结合,它不含生物素,可避免因内源性生物素引起的非特异性背景显色,省略了滴加非免疫血清这一步,本方法需要时间短,使整个操作过程大为缩短,3h内