nr1、nr2a与psd-95在大鼠海马发育过程中的表达

nr1、nr2a与psd-95在大鼠海马发育过程中的表达

n-甲基-d-氨基丙烯酸（n-methy1-d-a）是一种离子脂肪酸受体。至少有七个亚单位：nwdad、nsdad、nwdad和nwdab（nm-da，nr1）。哺乳动物中枢神经系统内NMDA受体从大脑皮层到脊髓都有广泛分布,不同部位脑组织中NMDA受体的含量不同,海马内含有丰富的NMDA受体。NMDA受体属配基和电压双门控的钙离子通道,在哺乳动物的中枢神经系统发育过程中对神经元的存活和迁移、突触可塑性和学习记忆等方面起着关键作用。一般而言,脑内功能性NMDA受体主要是由两个NR1和两个NR2亚单位组成的四聚体,NR1是NMDA受体基本的功能亚单位,广泛分布于脑内各区;NR2伴随NR1存在于特定脑区,决定其构成的NMDA受体的生理学和药理学特性。膜相关胍氨酸激酶(Membrane-associatedguanylatekinase,MAGUK)超家族包括突触后密度蛋白-95(Postsynapticdensityprotein95,PSD-95)/突触相关蛋白90(Synapse-associatedprotein90,SAP90),突触相关蛋白102(Synapse-associatedprotein102,SAP102),突触后密度蛋白-93(Postsynapticdensityprotein93,PSD-93)和突触相关蛋白97(Synapse-associatedprotein97,SAP97)等。PSD-95是MAGUK超家族的主要代表成员之一。在突触内,PSD-95可以锚定NMDA受体,与NMDA受体直接相互作用,对整合兴奋性信号转导、调节离子通道性状和突触可塑性等方面起着重要作用。PSD-95对NMDA受体的膜表面成簇和突触定位等作用因结合的不同NR2亚单位而有差异。目前,PSD-95蛋白家族与NMDA受体亚单位的关系仍存争议。有研究者利用多次免疫沉淀方法发现,纯化出的NR1/NR2A亚型NMDA受体和NR1/NR2B亚型NMDA受体与PSD-95和SAP102保持着相似的结合性。另有研究者利用细胞转染和免疫沉淀方法发现PSD-95更易与NR2B结合而非NR2A。此外,到目前为止由于缺乏NR1的相关检测技术,NR1可能存在的生理意义我们知之甚少。本研究应用免疫荧光方法观测NR1、NR2A与PSD-95在生后不同时期大鼠海马CAl、CA3区及齿状回(dentategyrus,DG)中的表达,进一步了解NR1、NR2A与PSD-95之间的关系及其在大鼠海马发育过程中的可能作用。1细胞培养和动物分组P0(出生当天)、P4、P7、P10、P14、P21、P28、P56(分别代表出生4,7,10,14,21,28,56d)的清洁级Wistar大鼠,每年龄阶段大鼠6只(雌雄不限,购自中国医学科学院实验动物研究所)。快速处死大鼠,取脑,OCT包埋,-80℃冷冻0.5h后,于-20℃密闭保存。冰冻切片机(CM1850,Leica,Mannheim,Germany)冠状位连续切片,片厚25μm。P0~P10的鼠脑切片每间隔50~100μm贴片,P14~P56的鼠脑切片每间隔100~200μm贴片保留,于-20℃密闭保存。TritonX-100,正常马血清,均购自中杉金桥。单克隆小鼠抗NR1抗体,购自BDPharmingenTM,多克隆兔抗NR2A抗体,购自Abcam,单克隆小鼠抗PSD-95抗体,购自Thermo。AlexaFluor488偶联的羊抗小鼠IgG二抗,AlexaFluor488偶联的羊抗兔IgG二抗,AlexaFluor594偶联的羊抗小鼠IgG二抗,均购自MolecularProbes。2荧光标记检测2.1NR1、NR2A与PSD-95免疫荧光染色取出切片盒置室温20min,开盖干燥20min。4﹪多聚甲醛固定切片15min,PBS洗涤后,入PBST30min,再入封闭液(5﹪正常马血清+0.3﹪TritonX-100+PBS)室温封闭30min。入一抗:NR1(1∶500)或NR2A(1∶200)或PSD-95(1∶200)室温反应2h后,入4℃冰箱过夜。PBS充分洗涤后分别加入荧光标记的二抗AlexaFluor488(1∶500)或AlexaFluor594(1∶500),避光,室温反应2h。阴性对照(以PBS代替一抗和二抗)的结果显示,目标区域无标记细胞。2.2半定量分析和统计学处理在荧光显微镜(DM5000B;Leica)下观察CA1、CA3和DG,激发波长和发射波长分别为470nm和525nm(AlexaFluor488),590nm和617nm(AlexaFluor594)。图像摄片后,用图像分析系统(LeicaQWinStandardV2.2)进行分析。选择区域的荧光强度通过图像分析软件测量。非参数Kruskal-Wallis检验用于每个抗体不同年龄阶段之间的比较,再用Mann-WhitneyU检验进行两两比较。相关分析用Pearson相关系数。数据以x±s表示,统计学处理用SPSS11.5处理。结果1ca1区nr1表达的变化NR1在生后各期海马结构各区锥体细胞层和颗粒细胞层均有表达,多形层和分子层未见明显表达,高倍镜下可见荧光集中表达在锥体细胞和颗粒细胞的胞体及胞膜上,胞核未见明显表达(Fig.7),但在不同时段的表达有显著差异(Fig.1)。在CA1区,NR1的表达在P0~P14逐渐增强,P14达高峰期(P<0.05vsP10),然后逐渐减弱至P56。在CA3区,NR1的表达在P0开始逐渐增强,P21达高峰期(P<0.05vsP14),随后轻微减弱,并在其余观测时段维持该水平。在DG,NR1的表达在P0~P14逐渐增强,P14达高峰期(P<0.05vsP10,然后减弱,P21后略有增强,P28后又轻微减弱至P56(Fig.2)。2ca1、ca3区和dg中nra表达的变化NR2A在生后各期海马结构各区锥体细胞层、颗粒细胞层、多形层和分子层均有表达,高倍镜下可见荧光集中表达在锥体细胞和颗粒细胞的胞体、胞膜及树突上,胞核未见明显表达(Fig.7),但在不同时段的表达有显著差异(Fig.3)。在CA1、CA3区和DG中NR2A的表达生后即减弱,P4达低谷期(P<0.05vsP0),之后各有不同。在CA1区,NR2A的表达在P4后逐渐增强,P14达高峰期(P<0.05vsP10),后逐渐减弱,P28后略有增强至P56。在CA3区,NR2A的表达在P4后逐渐增强,P14达到高峰(P<0.05vsP10),P21后轻微增强,P28后又轻微减弱至P56。在DG,NR2A的表达在P4后增强,P7后略微减弱,P10后急剧增强,P14后又轻微减弱,P21后再次增强,P28达高峰(P<0.05vsP21),然后减弱至P56(Fig.4)。3psd-65与nr1、nra的关系PSD-95在生后各期海马结构各区锥体细胞层、颗粒细胞层、多形层和分子层均有表达,高倍镜下可见荧光集中表达在锥体细胞和颗粒细胞的胞体、胞膜及树突上,胞核未见明显表达(Fig.7),但在不同时段的表达有显著差异(Fig.5)。在CA1、CA3区,PSD-95的表达在生后逐渐增强,P21达高峰(P<0.05vsP14),之后逐渐轻微减弱,并在其余观测时段维持该水平。在DG,PSD-95的表达在生后逐渐增强,P10后急剧增强,P28达高峰(P<0.05vsP21),然后减弱至P56(Fig.6)。PSD-95与NR1、NR2A的关系很复杂。在CA1区和CA3区,NR1、NR2A与PSD-95的表达于整个观察时段内呈正相关(NR1与PSD-95,rp=0.527,P<0.05;NR2A与PSD-95,rp=0.643,P<0.05);在DG,NR1与PSD-95的表达于整个观察时段内呈正相关(rp=0.481,P<0.05),NR2A与PSD-95在P0~P10期的表达呈负相关(rp=-0.228,P<0.05),但在P10~P56期的表达呈正相关(rp=0.439,P<0.05)。nmda受体与psd-65的相互作用海马是边缘系统的一个重要结构,在学习、记忆和突触可塑性等方面发挥重要作用,从低等动物到人海马有极大的相似性。一般认为,海马结构由海马、齿状回和下托组成。海马结构的锥体细胞于出生前发生,颗粒细胞于胚胎时期仅发生了一小部分,大部分于生后产生。中枢神经系统中突触的发育与NMDA受体关系密切。在发育期间,NMDA受体亚单位存在的不同时空变化模式可决定NMDA受体的不同功能,从而调控中枢神经系统的发育。PSD-95的N末端有3个PDZ重复序列,可通过前二个PDZ结构域(PDZ-2)直接与NMDA受体亚单位NR2A、NR2B和部分NR1剪接变异体的C末端结合,从而与NMDA受体直接相互作用,对整合兴奋性信号转导、调节离子通道性状和突触可塑性等方面起着重要作用。本课题组之前发现,PSD-95和NR2B在海马的表达具有明显的区域和细胞特异性分布模式,该模式可能与其在生后发育中发挥的不同生理功能相关。NR2A亚单位赋予NMDA受体对谷氨酸较低的亲和性,更快的反应动力学,更大的通道开放概率,以及比NR2B亚单位更显著的钙离子依赖性。在NR2A基因敲除的小鼠中,与NMDA受体免疫共沉淀的PSD-95的量明显减少;在PSD-95基因敲除鼠的海马中,发现记录NMDA受体的自发性突触后电流延迟时间增长,提示突触组分中NR2A减少,这都反映了PSD-95与NR2A之间作用的特异性。不同脑组织中的中间神经元有不同的NR2亚单位,NMDA受体的功能因不同NR2亚单位而异,但是NR2亚单位独立存在时,不表达受体活性,与NR1关系密切。因此,进一步了解NR1、NR2A与PSD-95在大鼠海马生后发育过程中的相互作用具有重要意义。一直以来,NMDA受体的膜表面成簇、突触定位及胞浆内运输等作用都被认为与PSD-95蛋白家族有关。PSD-95可以与NMDA受体直接发生作用,并在兴奋性突触部位高度密集存在,提示NMDA受体的表达可能与PSD-95的表达具有一定的相关性,但仍需进一步的研究证实。本研究采用免疫荧光方法观察到,NR1、NR2A和PSD-95在大鼠生后海马的表达具有明显的区域分布模式。在大鼠海马CA1和CA3区,NR1和PSD-95的表达生后即增强,P14~P21达高峰期后减弱;NR2A生后即减弱,P4达低谷期后增强,P14~P28达高峰期后轻微减弱至P56。这与原位杂交及免疫印迹的结果相符,即NR1亚单位在新生大鼠的所有脑区生后即表达,生后2至3周达高峰期,此后逐渐下降至成年水平,且各脑区呈现相似的变化模式;NR2A亚单位的分布和发育性变化模式类似于NR1。有研究发现,在大鼠脊髓内PSD-95的表达随发育时间逐渐增加,P14达高峰期后逐渐下降至成年水平,这也与我们的结果相符。我们发现,P4后NR1、NR2A和PSD-95在大鼠海马CA1和CA3区的表达均增强直至高峰期,NR1、NR2A在CA1和CA3区的表达与PSD-95正相关,结合我们之前的发现,PSD-95在CA3区和DG的多形层的表达与NR2B负相关,提示NR1和NR2A的表达可能协同PSD-95的表达,NMDA受体与PSD-95的相互作用可能具有受体亚型的特异性,为NMDA受体和PSD-95之间相互作用关系提供了进一步的证据。发育中的海马神经元NMDA受体对神经元的存活和迁移、突触可塑性和学习记忆等方面起关键作用,成熟神经元内NR1/NR2A组成的NMDA受体相对较稳定,且神经元树突上PSD-95蛋白簇特异地与膜表面NR2A-NMDA受体簇共定位。NR2A与PSD-95的结合具有稳定突触受体的作用,且随发育进程两者之间的结合可能越来越稳定。我们推测,发育过程中在海马CA1和CA3区与PSD-95结合的NR1和NR2A可能具有增多的趋势。有研究证实,激活NR2A-NMDA受体亚型或抑制NR2B-NMDA受体亚型可以诱导突触传递的长时程增强,并可在NMDA受体介导的兴奋性细胞毒性中抑制凋亡起保护神经元的作用;另有研究发现,在单一神经元中,含NR2B的NMDA受体不仅能介导凋亡信号,也能激活保护信号。因此,发育进程中在海马CA1和CA3区NR1和NR2A与PSD-95结合的增多趋势,可能是幼龄大鼠突触可塑性及学习记忆能力增强的原因之一,也可能是维持脑内成熟神经元数量保证其功能稳定的原因之一,其具体机制有待进一步研究。本研究还发现,在海马DG中,NR2A的表达生后略有减弱,P4后在增强的趋势中于P7、P14和P28后均有不同程度的减弱,在P0~P10期NR2A的表达与PSD-95呈负相关,提示海马DG的突触可塑性可能比CA1和CA3区更强。同时我们发现,NR2A在海马DG的表达高峰期在P28,比CA1和CA3区晚2周左右。这可能是由于DG和CA1、CA3区的神经元的不同发育模式所致。海马在发育进程中,CA1和CA3区锥体细胞层数逐渐减少,2~3周后趋于稳定,其神经元的树突也在该时段发育最快;DG中颗粒细胞层数逐渐增多,至成年也未稳定,终生都具有自我更新能力。既往认为,在发育中的海马神经元,由NR2A构成的NMDA受体仅表达在突触内,但近年有研究指出在突触外也并存着NR2A-NMDA受体。本研究所测得的NR2A的表达量是突触内外NR2A的表达总和。在哺乳动物表达系统中,NR1必须和NR2亚单位形成异寡聚体才能形成有功能的通道,NR2亚单位未与NR1亚单位结合时只能滞留在内质网上。发育中的海马内NMDA受体主要由NR1/NR2A,NR1/NR2B和NR1/NR2A/NR2B三种形式的异构体组成。我们发现在上述特定时段内海马DG中NR1和PSD-95的表达逐渐增多,但该时段内NR2A与PSD-95的表达又呈负相关。因此,我们推测其原因可能与特定时段内DG中NR2B的表达增多有关,此时与PSD-95结合的NR2A可能会减少,但其可能存在的生理作用及机制尚需深入研究。新生大鼠中,绝大多数NMDA受体由NR1和NR2B两种亚单位构成,成年鼠中NMDA受体则呈明显的异质性,主要由NR1、NR2A和NR2B3种亚单位构成。NR2A和NR2B与PSD-95的结合可稳定突