创面愈合中egf、egfr基因表达的动态变化

创面愈合中egf、egfr基因表达的动态变化

伤口愈合是一项复杂的病理过程，包括局部出血、渗出物、炎性浸润、细胞克隆分化和细胞外基质积聚。既往,笔者观察到:在动物供皮区创面和烧伤患者创面中,EGF、EGFr基因有明显的表达变化,提示:创面愈合中EGF、EGFr基因有明显的规律性表达变化,且与创面愈合过程明显相关。为进一步探讨EGF、EGFr基因表达变化与创伤愈合关系的普遍性,笔者又对临床供皮区创面愈合过程中的EGF、EGFr基因表达变化进行了研究,现报道如下。1材料和方法1.1供皮区扩张型选取烧伤或整形患者的中厚断层供皮区创面共32例,男19例,女13例,年龄22~49岁。患者无特殊疾患。供皮区创面位于大腿或下腹部。征得患者同意,分别于术后4天、10天、16天,在局麻下用眼科角膜环钻切取包括创面、创基及少量皮下脂肪在内的标本,并取正常皮肤作为对照。1.2egf、egfr基因表达分析固定,酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切成5μm的组织切片,用地高辛标记EGF、EGFrcDNA探针后,进行组织切片的原位杂交:组织切片脱蜡入水,0.2mol/L盐酸酸化,蛋白酶K消化,酒精脱水,置预杂交液(42℃)预杂交4h,入杂交液杂交(42℃)17h后,用Dig-DNAlabellinganddetection(BoegringerMannheim公司产品)试剂盒观察切片中EGF、EGFr基因活化表达的mRNA的变化情况,以确定创面愈合中EGF、EGFr基因表达状况。400倍光镜下测定其相对含量,以所见视野内无阳性细胞为阴性,连续记数5个视野,求出每个视野内阳性细胞数,当视野内有10个以下阳性细胞时,表达强度确定为弱阳性(+);当视野内有11~20个阳性细胞时,表达强度确定为中等阳性(++);当视野内有21个以上阳性细胞时,表达强度确定为强阳性(+++)。统计学处理应用组间方差分析2egf基因表达本组中厚断层供皮区创面愈合时间平均为18.5天(17.5~19.5天)。所用地高辛标记的EGF、EGFr基因cDNA探针进行的原位杂交阳性结果为蓝紫色细颗粒,分布于细胞浆或少量的胞核内。正常皮肤内无明显的阳性细胞。伤后4天,EGFr基因在创面内有明显的表达,主要分布在创面内的成纤维细胞胞浆和创缘上皮基底细胞胞浆内,以及血管内皮细胞和皮肤附属上皮细胞中,多较密集分布,表达强度为(++--+++),视野内平均阳性细胞数量为18.60±2.6;而EGF基因表达相对较弱,主要分布在创面浅层,阳性细胞呈稀疏分布,表达强度为(+),视野内平均阳性细胞数量为9.50±1.6。伤后10天,EGF基因在创面内表达较伤后4天增强,除分布在创面浅层的成纤维细胞胞浆和创缘上皮基底细胞胞浆内以外,尚可见分布在血管内皮细胞和皮肤附属上皮细胞中,创面的中层和深层也可见有表达,多较密集分布,表达强度为(+++),视野内平均阳性细胞数量为23.40±3.1;而EGFr基因表达较伤后4天减弱,分布范围减小,主要分布在创面浅层,表达强度为(+--++),视野内平均阳性细胞数量为11.50±1.3。伤后16天,EGF、EGFr基因在创面内表达的强度较伤后10天均减弱。EGF表达强度接近伤后4天的水平,仅限于在临近愈合上皮的浅层和创面的浅层,分布在成纤维细胞胞浆,表达强度近(+)左右,视野内平均阳性细胞数量为10.45±1.2;伤后16天,EGFr基因表达已基本阴性,视野内平均阳性细胞数量为2.3±0.6。统计学分析,伤后10天EGF基因表达较伤后4天和伤后16天明显增强,P<0.05;伤后4天和16天比较无明显差别,P>0.05;伤后4天EGFr基因表达较伤后10天增强,P<0.05;而伤后10天EGFr基因表达又较伤后16天明显增强,P<0.05。3断层供皮区宫腔内皮细胞的生长创面愈合是机体对外来损伤刺激而引起的一系列信号反应,其最终达到对损伤的修复,其中包括组织细胞的迁移增殖、肉芽组织的形成、细胞外基质沉积、再上皮化等过程。在创伤修复中,许多种生长因子及其相关基因发挥作用,调节和控制了其发展变化和结果;在这些生长因子中,EGF和EGFr是很重要的生物分子,各种刺激引起EGF、EGFr基因表达后,组织中EGF、EGFr增多,促进细胞分裂增殖,加快创面愈合。EGF通过与EGFr结合发挥作用,而EGFr也是体内许多生长因子的共同作用途径,对介导多种生长因子的作用起很重要的调节作用,EGF可以诱导皮肤干细胞快速定向分化,促进损伤皮肤再生。本研究表明:在人的中厚断层供皮区创面愈合过程中,EGFr基因在伤后4天、EGF基因在伤后10天均有明显的表达,EGFr基因表达为由强到弱,伤后4天表达强度大于伤后10天,伤后10天表达强度大于伤后16天;EGF基因表达为由弱到强,再由强到弱,EGF基因表达伤后10天时较伤后4天和伤后16天明显增强;伤后4天和16天比较无明显差别。笔者知道:创面愈合过程中伤后4天,创缘和创基增殖虽不明显,而此时EGFr基因表达可能有助于细胞EGFr蛋白的合成,细胞高含量的敏感EGFr又有助于细胞结合EGF蛋白,发挥EGF生物效应。从时相上看,EGFr基因早于EGF基因的高表达更体现了组织细胞在为明显的宏观修复做好生理和生化方面的准备。伤后10天正是细胞增殖组织修复的旺盛时期,这与EGF、EGFr基因的高强度表达也相一致;本组断层供皮区创面愈合时间为18.5天,伤后16天,创面已大体愈合,创面基本上皮化,此时组织内细胞虽仍有增殖,但EGF、EGFr基因表达已明显减弱,创伤修复调控已发生很大变化。这种机体内在的EGF、EGFr基因变化可能是皮肤组织修复“接触性抑制”和避免过度增生的机制之一,可以看出有很强的生理意义。从表达的细胞可看出EGF、EGFr基因多表达在创缘和创基的成纤维细胞、血管内皮细胞、皮肤附属上皮细胞,这些部位的细胞EGF、EGFr基因高表达就可以使局部产生更多的EGF、EGFr蛋白,这样就有助于组织的修复。有人报道,将EGF和水凝胶一起做成制剂,利用水凝胶缓慢释放特性延长EGF药效,可以达到促进创面修复的作用;还有人将骨髓间充质干细胞与EGF一起制成微囊,应用于人工皮肤中观察对创面愈合的影响,发现可以取得更有效的修复效果。笔者