教学课件·植物组织培养

1、植物组织培养温州医科大学生命科学学院0 绪论0.1 植物组织培养的简介0.1.1 植物组织培养的概念植物组织培养（plant tissue culture）：是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用人工培养基，对离体的植物胚胎、器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。又称为植物离体培养（plant culture in vitro）。植物组织培养是一门研究植物离体培养的生物技术学科。基础学科：植物生理学无菌：无真菌、细菌、病毒等微生物。人工控制的环境条件：光照、温度、湿度、气体等。离体生态学（in vitro ecology）：是指研究离体培养环境条件控制的科学，其研究

2、对象是培养基、植物材料和人工环境条件。外植体（explant）：用于离体培养的那部分植物器官、组织或细胞。愈伤组织（callus） ：是指外植体因受伤或在离体培养时，其细胞进行活跃的分裂增殖而形成的一种无特定结构和功能的组织。采用微生物学的实验手段来操作植物离体的器官、组织和细胞。0.1.2 植物组织培养的特点具体表现为以下方面：组培技术是无菌操作技术。组培材料处于完全的异养状态。组培材料可以是离体状态的器官、组织、细胞或原生质体。组织培养物可以形成克隆（clone，无性繁殖系），也可以进行茎芽增殖或生根。组培容器内的气体和环境气体可通过封口材料进行交换，相对湿度通常是几乎100，因此，组培苗

3、叶片表面一般都无角质层或蜡质层，且气孔保卫细胞功能缺乏，气孔始终都是张开的。组培的环境温度、光照强度和时间都是人为设定的，其参数可调。0.1.3 植物组织培养的研究类型和任务组织培养：分生组织、形成层组织、薄壁组织、韧皮部组织等。器官培养：根、茎、叶、花、果实、种子。胚胎培养：幼胚、成熟胚、胚乳、胚珠、子房等。细胞培养：单细胞或较小细胞团，如性细胞、叶肉细胞、根尖细胞、韧皮部细胞等。原生质体培养研究任务：研究离体培养条件下，细胞、组织或器官所需营养条件和环境条件，细胞、组织或器官的形态发生和代谢规律，植物脱毒方法和机理，植物特别是一些难繁植物的大量快速繁殖方法，细胞融合方法和机理，再生个体的遗

4、传和变异，种质资源的离体保存机理和方法等。0.2 植物组织培养的形成和发展开创阶段（上世纪初上世纪30年代末）1. Schleiden 和Schwann 植物组织培养的理论基础源于德国植物学家Schleiden和动物学家Schwann于1838-1839年提出的细胞学说：一切生物都是由细胞构成，细胞是生物体的基本功能单位，细胞只能由细胞分裂而来。 2. Haberlandt 德国植物学家Haberlandt被公认为是植物组织培养之父，他于1902年发表的植物组织培养的第一篇论文：提出了植物细胞具有全能性，构思了细胞培养的概念。Haberlandt选择了栅栏组织细胞、髓部细胞、雄蕊绒毛以及气孔保

5、卫细胞进行实验，将这些细胞培养在有机物丰富并含有葡萄糖的Knop培养液中，在无菌条件下进行培养。细胞没有分裂，但存活了几个星期并有生长。失败的主要原因：1）实验材料高度分化。 Haberlandt没有意识到，由于可进行光合作用的细胞相应地已经分化了，它们的分生组织潜能不容易表达。2）培养基过于简单。 Haberlandt不知道细胞脱分化成为分生组织状态需要刺激物质，植物生长调节剂当时还未发现。3. Kotte and Robbins1922年，植物离体组织培养取得了一些进展。德国人Kotte和美国人Robbins两人同时分别独立地将分生组织作为外植体。Kotte研究切下的根尖，如豌豆、玉米根尖

6、，将它们放在含有Knop溶液盐成分、葡萄糖、含氮化合物如天冬酰氨酸、丙氨酸以及肉汁的各种营养液中。Kotte观察到根尖生长持续了2周，但他没有进行继代培养。另一方面Robbins通过继代，将玉米根尖离体培养了更长的时间，但随着时间延长，生长量减少，最后消失。4. Hanning、Knudson和Laibach1904年，Hanning在无机盐和蔗糖溶液中对萝卜和辣根菜的胚进行了培养，发现离体胚可以充分发育成熟，并提早萌发形成小苗。1922年，Knudson采用胚培养法获得了大量的兰花幼苗。1925年，Laibach培养亚麻种间杂交幼胚获得成功，证明了胚培养在植物远源杂交中利用的可能性。在植物组

7、织培养研究的开创时期，由于影响植物组织和细胞增殖及形态发生能力的因素尚不清楚，培养材料的选择十分重要，在30多年的探索实验中，植物组织培养几乎没有大的进展。奠基阶段（上世纪30年代上世纪50年代末）1. 李继侗和沈同1933年，他们首次报道了利用天然提取物成功进行植物组织培养的研究。利用加有银杏胚乳提取物的培养基，成功培养了银杏的胚。2. White、Gautheret and Nobecourt1934年，美国植物生理学家White用添加了酵母提取物（YE）的培养基进行了番茄根的离体培养，建立了第一个活跃生长并能继代增殖的无性繁殖系，从而使非胚器官培养首次获得成功。同年，法国学者Gauthe

8、ret在添加了YE和水解酪蛋白（CH）的固体培养基上，使山毛榉和欧洲黑杨的形成层培养物连续增殖了几个月，这是固体培养基在植物组织培养上的首次成功应用。1937年，White又发现酵母提取物的作用可以被B-族维生素（硫胺素，VB6，烟酸）所取代，建立了第一个由已知化合物组成的培养基。 1939年，White建立了连续生长的烟草杂种培养物。同时期， Gautheret在山毛榉和胡萝卜形成层、Nobecourt在胡萝卜根和马铃薯块茎上也建立了连续生长的培养物。WhiteGautheretNobecourt White 和 Gautheret 获得的愈伤组织，由含有大液泡的薄壁组织组成。3. Skoo

9、g和Miller 1954年，Skoog于做了一个著名的实验。在烟草愈伤组织培养中用了变质的鲱鱼精子DNA，发现它可促使愈伤组织加快生长。有效成分存在于变质的DNA样品或者经高压灭菌后的新鲜样品中，他指出有效成分是降解的DNA产物。1955年，他把这种物质命名为激动素（KT）。1956年，Miller首次从鲱鱼精子中分离出激动素。 Skoog Skoog和Miller的烟草髓部愈伤组织培养实验 1957年，Skoog和Miller提出激素控制器官形成的观点。在这篇著名的论文中，他们提到在烟草髓部愈伤组织培养中，根和芽的分化由生长素和细胞分裂素的比率决定，并且器官分化可以通过改变培养基中两种激素

10、的浓度进行调节。高浓度的生长素诱导生根，而高浓度的细胞分裂素促进芽的形成。两者浓度相当时则倾向于未分化样式的生长。这一对激素调节器官分化的观点现在已在大多数植物种类中被证实。 4. Muir、Steward和Reinert1953年，Muir利用往复式摇床的振荡，在液体培养基中进行了万寿菊和烟草愈伤组织的培养，获得了单细胞或密集细胞的悬浮液，并可继代增殖。这既是培养方法上的突破，也是Haberlandt培养单细胞设想的实现。1958年，英国学者Steward和Reinert几乎同时在胡萝卜根组织的韧皮部单细胞悬浮培养液中诱导出胚状体，并长成完整植株。证实了Haberlandt的细胞全能性理论。

11、 建立和发展阶段（上世纪60年代至今）从植物细胞全能性理论的提出到其被实验科学地证实，植物组织培养研究领域走过了近60年的发展历程。当影响植物细胞分裂和器官形成的机理被揭示后，学者们对该领域进行了全面研究，获得的成果枝繁叶茂，发表的文章浩如烟海，形成了一套成熟的植物组织培养的理论体系和技术方法，拥有着极其广泛的应用领域，从而在生物科学中建成了这门具有理论、技术和应用的科学。1. Thimann和Wickson 1958年，他们发现腋芽（当顶芽存在时为休眠状态）的生长，可以通过外源细胞分裂素的应用而启动。这样，将茎段培养在含有细胞分裂素的培养基上，就可以在一个具有完整顶芽的生长中的茎上诱导侧芽的

12、形成。这将消除顶端优势，得到大量不定芽。Thimann2. Morel脱毒、快繁商业化1952年， Morel和Martin提出了植物脱毒（virus free）技术，通过分离已被病毒感染的大丽花个体的根尖，并将其离体培养，重新获得了无病毒的大丽花。1960年，Morel利用兰花茎尖培养，实现了脱毒和快速繁殖（rapid clone propagation）的两个目的。这一技术导致欧洲、美洲和东南亚许多国家“兰花工业”的兴起。Morel3. MurashingeMurashinge发展了一套标准的离体繁殖方法，将这一技术广泛普及。与Skoog一起筛选出至今仍被广泛应用的MS培养基。4. Guh

13、a和Maheshwari等花药培养1964-1966年，印度学者Guha 和Maheshwari成功地由曼陀罗花药培养获得单倍体植株，开创了花粉培育单倍体的新途径。1973年，Nitsch采用花药预培养方法获得了烟草花粉植株的纯合二倍体。 1974年，Sunderland建立了散落花粉系列培养法。1982年，Ghandimathi和Imamura直接分离花粉进行 培养成功，建立了一个适于深入研究雄核发育的实验体系。MaheshwariNitschNitsch发展了培养烟草和曼陀罗小孢子的技术、单倍体染色体加倍的技术，并且在5个月之内收集到二倍体纯合子的种子（Nitsch, 1974, 1977

14、）。 5. Cocking等-原生质体培养1960年，英国学者Cocking首次用酶解方法获得了原生质体，开创了植物原生质体培养的研究。1971年，日本学者Nagata和Takebe首次将烟草叶肉原生质体培养出再生植株。1985年，Fujimura获得首例禾谷类水稻的原生质体培养的再生植株。1986年，Spangenberg获得了甘蓝型油菜的原生质体培养的再生植株。Cocking6. Carlson等原生质体融合1972年，Carlson利用硝酸钠进行了烟草种间原生质体的融合实验，获得了首株体细胞种间杂种植株。1974年，Kao利用聚乙二醇（PEG）进行了大豆和烟草科间原生质体的融合，获得了3

15、的异质体。同年，Bonne和Eriksson利用PEG成功进行了具有叶绿体的海藻和不具有叶绿体的胡萝卜根原生质体的融合。1978年，Melchers获得了首个属间杂种植株（马铃薯番茄）。1981年，Zimmerman提出了原生质体融合的新方法电融合。Melchers植物遗传操作成功的前景引起了大众的兴趣。Melchers和他的同事（1978年）通过将马铃薯和番茄原生质体融合，允许遗传信息在两个不同的有机体中移动，获得了一个杂种植物。这一方法提供了获得亲缘相近但生殖隔离的种间杂种的机会。7. Kaul等次生代谢物生产1969年，Kaul发现三角叶薯蓣悬浮培养物可以生产薯蓣皂苷配基。1973年，F

16、uruya和Ishii发现人参培养细胞可以产生人参皂苷。Nickell组织培养的先驱，尤其是在培养中次生代谢物质的生产方面。 Street培养设施化Street和他的助手开创了各种细胞悬浮培养的程序（恒化器和恒浊器）。 0.3 植物组织培养的应用及展望快繁和脱毒育种次生代谢物生产种质保存在遗传、生理、生化、病理等研究上的应用1. 离体快繁（试管苗和人工种子）和脱毒1）试管苗在生产上应用最广泛、经济效益较大。特点：繁殖系数大、速度快，苗木整齐一致，周年生产。一个单株一年繁殖几万到几百万个植株。葡萄：3万，兰花：400万，草莓：108 。尤其适用于“名、优、特、新、奇” 品种、脱毒苗、优良单株、濒

17、危植物和基因工程植株等的繁殖。目前园艺作物及经济林木等部分或大部分都用离体快繁提供苗木。美国Wyford国际公司年产花卉、蔬菜、果树及林木的组培苗3000万株。以色列Benzur苗圃年产观赏植物组培苗800万株。我国工厂化生产的组培苗有：香蕉、甘蔗、桉树、葡萄、苹果、脱毒草莓、脱毒马铃薯、非洲菊、芦荟。Fig. 1. Mass propagation of multiple shoot cultures of Artemisia annua青蒿2）人工种子（artificial seed）人工种子的概念是1978年Murashinge首次提出的，它是指植物离体培养中产生的胚状体或不定芽，被包裹

18、在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中，从而形成能发芽出苗的颗粒体。具有试管苗的优点外，还具有以下优点：1）便于贮藏和运输、可直接播种和机械化操作；2）可在人工种子中加入抗生素、菌肥、农药等成分，提高种子活力和品质。前途是光明的，道路是曲折的。人工种子3）脱毒苗木培育很多作物特别是无性繁殖作物都带有病毒，影响产量和质量，对生产造成极大损失。草莓主要病毒有4种，大蒜和马铃薯的病毒有10多种。感病植株并非每个部位都带有病毒，生长点附近的病毒浓度很低甚至无毒。利用茎尖组培，再生植株就可脱毒，获得脱毒苗。应用：水果（甘蔗、菠萝、香蕉、葡萄、草莓等）、蔬菜（马铃薯、大蒜、洋葱等）、花卉（兰花、菊花、

19、唐菖蒲等）等。茎尖培养用于脱毒2. 培育新品种或创制新物种单倍体育种离体选择突变体培育远源杂种基因工程育种单倍体育种手段：花药和花粉培养优点：所有基因均能表现，基因型可快速纯合。成果：已育成大面积种植的品种。1974年我国育成第一个新品种烟草单育1号，此后还育出水稻中花8号、小麦京花1号和大量花培新品系。单倍体植株单倍体加倍离体选择突变体愈伤组织、悬浮培养细胞易变异、细胞数量大，有利于突变体筛选。多用于抗性筛选。已选出一些抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白的突变体，有些已用于生产。体细胞变异突变体筛选培育远源杂种胚培养可克服受精后障碍导致的远源杂交不孕，产生远源杂交后代，育成新物种。已育成苹果和梨、

20、大白菜和甘蓝、栽培棉和野生棉等杂交种。原生质体融合可克服有性杂交不亲和性，获得体细胞杂种。已获得马铃薯和番茄、烟草和龙葵等属间杂种，但尚无实际应用价值。典型的原生质体烟草原生质体Aechmea fasciata (X400)Ti导入的原生质体原生质体远缘杂交基因工程育种农杆菌介导法、基因枪法均基于植物组织培养技术。抗除草剂、抗虫、抗病、抗逆性、品质改良。转基因作物已占种植面积的1/5左右。转基因技术基因枪技术3. 次生代谢物生产利用组织和细胞的大规模培养，可以生产人类需要的一些天然有机化合物，如蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料、生物碱及其他活性化合物。已从200多种植物的培养组织或细胞中获得了5

21、00多种有效代谢化合物，包括一些重要药物。如人参皂苷、喜树碱、降压灵等。特别适于天然植物蕴藏量少、含量低、临床效用高的成分，如紫杉醇等。Fig. 2. Scale-up of Catharanthus roseus 长春花cell cultures in a 20 litre air紫草发酵罐培养4. 植物种质资源的离体保存常规保存手段耗费人力、物力和土地。1975年，Henshaw和Morel首次提出了离体保存植物种质的策略。优点：节约人力、物力和土地，防止有害病虫的传播，便于种质资源的交换和转移。已有多种植物保存。如草莓茎培养物可保存6年。5. 在遗传、生理生化、病理等研究上的应用已成为植

22、物科研的常规方法。遗传：单倍体、纯合二倍体、无性系变异等。生理生化：植物营养、生长活性物质、光合代谢等。病理：单细胞或原生质体培养快速鉴定抗病性、抗逆性等。复习思考题什么是植物组织培养？简述植物组织培养的特点及分类。何谓离体生态学、外植体和愈伤组织？植物组织培养有那些方面的应用？3 植物组织培养的基本技术3.1 培养基的成分与配制技术3.2 基本操作3.3 离体培养体系的建立3.1 培养基的成分与配制技术成分母液配方pH值制备3.1.1 基本成分水矿质元素碳水化合物生理活性物质生长调节剂附加物天然添加物1. 水（H2O ）水：可靠的水质是实验的保证可以使用以下装置：水质软化装置离子交换反向渗透

23、蒸馏离子交换设备2. 矿质元素大量必需元素（加入mM量级）：氮、磷、钾、钙、镁、硫微量必需元素（加入 M量级）：铁、锰、硼、锌、铜、钼其他：碘、镍、钴、铝等3. 碳水化合物作用：提供碳源、维持渗透压。通常碳源用蔗糖，高压灭菌后蔗糖大部分水解为葡萄糖和果糖。浓度范围15%，但在幼胚、茎尖、花药等培养时可达10甚至更高。低浓度（1.52.5）的糖有利于木质部的生长；高浓度（34）有利于韧皮部；4. 生理活性物质维生素肌醇氨基酸及其酰胺类单核苷酸维生素（0.110mg/L）作用：辅酶注意事项：易高温降解，过滤灭菌。硫胺素（VB1）：全面促进生长。吡哆醇（VB6）烟酸（VB3）VC：抗氧化剂，防止褐变

24、。肌醇作用：帮助活性物质发挥作用，使培养物快速生长，促进胚状体及芽的形成。一般用量：50100mg/L。氨基酸及酰胺有机氮源、缓冲作用、调节体内平衡。甘氨酸：促进离体根的生长。丝氨酸、谷氨酰胺：有利于花药胚状体或不定芽的分化。水解酪蛋白（CH）、水解乳蛋白（LH）：氨基酸混合物。5. 植物生长调节剂： 目前公认的已用于植物组织培养和生长操作的有六大类植物激素。它们是：生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯和油菜素内酯。此外还有一些具有植物激素特征的化合物。天然生长素 在植物中发现的天然生长素主要是吲哚-3-乙酸（IAA）。在植物分生组织区浓度很高，与许多生理反应有关。与植物组培有关的作用主要

25、是在细胞分裂和有丝分裂过程。生长素的一个主要应用是促进生根，因此被广泛用于切段的微繁和生根培养。然而，不可忽视它可抑制根的伸长。合成生长素： 最广泛使用的合成生长素：吲哚-3-丁酸IBA、-萘乙酸（NAA）和2,4-二氯苯氧基乙酸（2,4-D）。通常与细胞分裂素联用。这些生长素对光、温的稳定性高于IAA，可以经高压灭菌。 其余较少用的生长素包括：2-萘氧乙酸（NOA）、4-氯苯氧乙酸（4-CPA）、2-甲基-4-氯苯氧乙酸（MCPA） 、2,4,5-三氯苯氧基乙酸（2,4,5-T）、3,6-二氯茴香酸(麦草畏)、4-氨基-3,5,6-三氯吡啶羧酸（毒莠定）。细胞分裂素 细胞分裂素是腺嘌呤6位上

26、的N被其他基团取代的衍生物，与生长素共同作用促使植物细胞分裂。玉米素是最早被分离的细胞分裂素。呋喃甲基腺嘌呤和苄基腺嘌呤是最早合成的。细胞分裂素主要在植物的根部合成，运输到茎干。在组织培养中对芽的形成和器官分化起主要作用。均二苯脲（DPU）从椰子汁中提取，具有类似细胞分裂素活性，常作为微繁的附加成分。常用的细胞分裂素：苄基腺嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）、激动素（KT）。Thidiazuron（TDZ）已广泛用于组织培养。TDZ抑制细胞分裂素氧化酶，从而降低细胞分裂素的新陈代谢，使得细胞分裂素在组培过程中维持较高的水平。 赤霉素 赤霉素对热敏感，因此在组培中不常用。使用时，在培养基高压灭菌后

27、，对它单独过滤除菌。它们主要的作用是刺激植物亚顶端分生组织的扩展生长。因此常用来刺激芽的伸长，如对矮稻的生物测定可明显看到其作用。赤霉酸（GA3）是在组培中用得最多的赤霉素。脱落酸 脱落酸（ABA）是植物生长的强有效的抑制剂。与其他生长因子相互起作用。在组培中广泛用来促进体细胞胚发育为成熟的胚，并转化为小植株。乙烯 乙烯是气态的，是一种挥发性的激素。要将这种激素降低到最小程度，培养容器大小，尺寸以及密闭方法就显得非常重要。在过去的几年发展了大量的植物生长调节剂。由于它们更强的活性、稳定性以及低廉的价格，在植物组培中它们的用途也不断地扩展。生长素/细胞分裂素相互作用 在Skoog和Miller工

28、作的基础上，已经建立起很好的生长素细胞分裂素比率关系，用于组培中决定芽和/或根的形成。细胞分裂素对生长素的浓度比值高时，倾向于形成芽，而生长素细胞分裂素的浓度比值高时，倾向于形成根。两种激素的比值处于中间水平时增强愈伤组织的形成。6. 附加物胶凝剂螯合剂渗透剂活性炭其他胶凝剂： 琼脂：从藻类中提取的天然产品，710 g/L。琼脂一般都含有杂质，特别是钙、镁和微量元素，在营养研究时应避免使用。Gelrite：一种吉兰多糖（异多糖），是假单胞菌产生的胞外多糖，2.02.5 g/L。不同品牌其物理化学特征不同螯合剂 Chelates可与金属阳离子（主要是铁）形成复合物，使其溶解于溶液中。 EDTA：

29、乙二胺四乙酸EDDHA：乙二胺二邻羟苯基大乙酸铁钠 渗透剂 Osmotic agents组培培养基的渗透能力影响水和各种成分的可用性。蔗糖的浓度大于2%常常是由于其渗透效果而非作为碳源的作用。大多数情况下甘露醇仅作为有渗透效果的糖醇，而不参与代谢变化。活性炭Charcoal（0.53）使培养基变黑（根部环境）。吸附分子，特别是带有环状结构的植物生长调节剂。可能含有刺激因素（如多胺）。由于吸附能力的不同，活性炭的商标很关键。在高压灭菌前加入会降低培养基的pH值，使琼脂不易凝固。7. 天然添加物椰乳（CM）、水解酪蛋白（CH）、酵母提取液（YE）等。作用：提供天然微量营养成分、生理活性物质和生长调

30、节剂等。缺点：成分不确定，影响实验重复性。3.1.2 母液（贮备液）10倍、100倍或更高倍数，冰箱贮存。贮备液：大量元素20倍贮备液：微量元素200倍贮备液：铁盐200倍贮备液：有机物质（除了蔗糖）200倍各种激素贮备液分别配制：0.1mg/L或1mg/L注意事项：各种药品要充分溶解后才能混合。混合时要注意先后顺序，避免相互结合生成沉淀。铁盐单独配制，一般用硫酸亚铁和EDTA-Na2通过加热形成稳定的螯合铁贮存。生长素类先用少量95乙醇或1mol/L NaOH加热助溶后，用水定容。细胞分裂素类先用少量1mol/L盐酸溶解，再用水定容。3.1.3 配方基本培养基：MS、B5、White等。激素

31、配比：主要是生长素和细胞分裂素的比例。如：MS + BA2 + NAA0.10.23.1.4 pH值一般5.66.0。高压灭菌后稍有下降，所以灭菌前要略调高。大于6.0，培养基变硬；低于5.0，琼脂凝固不好。一般用1mol/L的盐酸或氢氧化钠调节。培养阶段pH值会改变 3.1.5 培养基制备加一定量水，依次加入需要量的母液。加入需要量的蔗糖，溶解，定容。调节pH值。加入需要量的琼脂，加热溶解（要不断搅拌）。分装：在琼脂未凝时（40左右凝固）分装，量一般为容器的1/41/3，注意不要沾到容器口。封口。灭菌。存放。注意事项：不能高压灭菌的物质，在灭菌后温度下降但琼脂尚未凝固时，在无菌条件下，用过滤

32、除菌法加入。配好的培养基一般应在两周内用完。3.2 离体培养体系的建立3.2.1 外植体的选择和处理3.2.2 培养条件3.2.1 外植体外植体（explant）从需要培养的母株分离的一小块植物材料。接种体（inoculum）已经培养的植物材料用于继代培养。地上部比地下部清洁。外植体越小，克服特殊植物病理问题（如病毒、支原体、细菌）的机会越大，但同时也降低了存活率。内部的组织比外部的不易受到污染。不同外植体反应不总是相同。外植体的选择2. 外植体的灭菌 根据培养容器大小将材料切割成适当大小；流水（自来水）冲洗植物表面；在酒精中晃动几秒钟；HgCL2（0.11%）吐温（润湿剂）2滴/100ml：

33、35min；用经过高压灭菌的蒸馏水冲洗；商业漂白剂715%吐温2滴/100ml：1030min；再用经过高压灭菌的蒸馏水冲洗几次。注释自来水：除去尘土，清洁剂去掉表面垢污。 酒精：70%酒精使蛋白质失活。95%有时被用来溶解外植体表面的腊质层。 NaOCl（商业漂白剂）或Ca(OCl)2：活性在于Cl- 和其他氧化反应。 HgCl2活性在于Cl-和使蛋白质失活的重金属。 润湿剂（例如：吐温20或80）可以加到上述溶液中。 *汞对环境是有毒的，因此汞溶液使用后收集到一个大的容器中。在溶液中加入氨水，汞可以沉淀。兰花花枝的无菌消毒3.2.2 培养条件温度光照湿度气相条件温度 事实上要对每种特定的植

34、物甚至每一特定阶段调整最优化的温度。对大多数植物日间培养室的温度调节点在22 2C。夜间的温度通常要低几度。容器内的温度要比室温高（可达5C）。培养室的一个主要的问题是维持始终如一的温度。保障措施：需要安装一个很大的自动调温器，当温度太高时可以关掉灯光 光通常用荧光灯，在架子上平行安放。大多数情况是装在培养室的外面，以避免热。 以下的光参数是重要的：光周期 和光强光周期大多数情况光周期不是最重要的。通常是16小时光照。为了节省能源和降低安装费培养室内不同架子上的灯不必同时打开。光强 适当的光密度是30 mol m-2 s-1，这一光强下为混合培养类型。自养型组培则需要达到250 mol m-2

35、 s-1。 依据不同类型的容器，容器内的光强或多或少被减弱。 PAR Photosynthetic active radiation PAR每秒每平方米波长在400700nm之间的光子摩尔数 LUX是一个不太合适的单位，因为它基于人眼的敏感性 光谱光谱是光形态建成的因素（植株高度以及叶片伸展）重要的比率：蓝光/红光，红光/红外 光谱因灯不同而不同湿度 Humidity 培养室的相对湿度（RH）通常不控制。标准容器其顶部空间水蒸气饱和。容器内的RH可以通过不同的装置控制通风，底部冷却，琼脂浓度 。容器气体组分在组培容器中顶部空间的成分组成与温室空气有显著的区别，见下表 ：其他挥发性气体含量微小。

36、 componentgreenhouse environmentcontainer atmosphereO222 %as low as 4 %N277 %up to 87 %CO2 365 - 1000 ppmup to 20 %water vapour60-85 % 100 %ethylene5 ppb - 100 ppb 2 ppm顶部空间气体成分对植物生长发育的影响： 矮化或白化 玻璃化软腐自养/混合营养乙烯伤害矮化或白化有限的气体交换对组培的效应组培容器尽可能密闭，以防止污染。然而，在一个完全密闭的容器中可能出现气体的堆积，对植物生长造成不利，如产量减少、白化病或坏疽。Fig. 1:

37、growth reduction Fig. 2 Albinism玻璃化Hyperhydricity玻璃化是在植物组培过程中的一种生理混乱现象。程度有低高之分。程度低的话在培养初期不会遇到大的问题。但程度高的话在培养的各个阶段都有可能遇到严重的问题。 玻璃化症状 玻璃化的症状通常不易用肉眼观察到。植物易感或培养条件非常不利则会出现可见的症状。培养条件非常不利的例子：细胞分裂素浓度过高水分含量过高容器过于密实胶凝剂浓度过低 产生原因原因是多方面的。然而许多因素只是当培养系统的条件没有达到最优化时表现诱导或激发玻璃化。下列可以作为考虑的因素： 外植体：种类，栽培变种；继代间隔时间；继代次数；切割方法

38、；在培养基上的放置情况。 培养基：凝胶的浓度和类型；有无液体层；细胞分裂素的种类及水平；盐浓度。容器：气体组成和气体浓度。 环境：温度；光强和光质，湿度；空气流动 补救方法培养基成分：培养基用较高浓度的凝胶固化，也可以使用有较高凝固能力的凝胶剂；降低细胞分裂素的浓度。容器特征：不太密实的装置，比如气透性膜；增加水蒸气和其他气体与周围环境的交换，从而调节容器的顶部空间气体成分；环境条件：底部冷却；增加光强；在不含BA的培养基上冷藏。底部冷却 大部分容器的底部由于灯产生的微弱热量而变暖。结果水蒸气在冷的盖子上凝结成水滴。容器内相对湿度可以通过冷却底部来控制，这样水蒸气就在培养基表面凝结。培养基温度

39、和盖子下面的温度差别越大，相对湿度就越低。例如：培养基20 ，盖子下部 23，RH为 85% 。 各种容器和封口装置复习思考题简述用于植物组织培养的培养基的组成。如何选择外植体？请详细说明外植体灭菌的方法。植物组织培养需要哪些环境条件？1.1 植物细胞的全能性植物细胞全能性（totipotency）：是指任何携带完整遗传信息的植物活细胞都具有表达其所有遗传信息的能力，能够发育成完整的植株。全能性是一种可能性，变为现实必须满足两个条件：解除抑制和给予刺激。细胞需经过脱分化和再分化过程才能表现其全能性。1 植物组织培养的基本原理1.2 植物细胞的分化与脱分化脱分化（dedifferentiatio

40、n）：成熟细胞或分化细胞转变为分生状态（即形成愈伤组织）的过程。再分化（redifferentiation）：成熟细胞或分化细胞脱分化转变为愈伤组织后重新分化成异质细胞的过程。1.3 植物的形态建成1.3.1 愈伤组织的诱导、生长和保持伤口可能导致愈伤组织的形成。愈伤组织形成可以在几乎所有的活的植物中发现。伤口愈伤组织的开始是植物的一种自我保护反应；内源植物激素水平的改变，结果使细胞分裂具有活性。机械损伤、微生物入侵以及昆虫的袭击也可以导致愈伤组织产生。Wound callus on the stemof an Erythrina tree1.3.1.1 愈伤组织的诱导愈伤组织起源于母体组织增

41、殖细胞。在培养时，通过把全植株的一小部分（外植体）在无菌条件下放到支持生长的培养基上来产生愈伤组织。激素改变了细胞的代谢使之从静止转变为具有活性。来自于叶组织来源于根来源于维管组织来源于胚组织培养条件固体培养基暗培养液体培养基的缺点污染损失大不利于气体交换，影响愈伤组织形成。诱导期（启动期）细胞准备分裂。因植物种类和外植体状况而异。对大多数植物，愈伤组织建立相对比较容易；如双子叶植物、单子叶植物、裸子植物、蕨类植物以及苔藓等。来自多种器官的组织在适当的培养基上可能都有分裂和增生扩散的潜能，然而，某些组织似乎比另一些更倾向于使细胞快速分裂。一般需要1天到几天。1.3.1.2 愈伤组织的生长诱导期

42、后，外植体外层细胞开始分裂，在组织受伤表面形成一种创伤形成层，愈伤组织的细胞数目迅速增加。特点：细胞分裂速率大大超过细胞伸长速率，单个细胞的平均重量下降，体积变小。如菊芋外植体培养7d后，细胞数目增加10倍以上，鲜重仅增加1倍。愈伤组织类型质地：松脆、致密高生长素：致密变松脆。低或无生长素或高细胞分裂素：松脆变致密。 颜色：白色、黄色、绿色、红色1.3.1.3 愈伤组织的保持一段时间后，由于基本培养物的损耗、凝胶的干燥以及代谢物的积累，需要将愈伤组织转到新鲜的培养基上进行继代培养。愈伤组织继代培养时要有适当的大小，以保证在新鲜培养基上可以重建生长。通常每36周进行继代培养。Typical ca

43、llus growth curve. X indicates time for subculture大多数情况下，随继代培养代数的增加和培养时间的延长，愈伤组织出现生长势下降、褐变、分化和形态发生能力逐渐降低甚至死亡或发生能力完全丧失。遗传因素：染色体畸变、基因突变。生理因素：细胞内激素平衡或细胞对外源生长物质的敏感性发生改变。延长培养期可能使愈伤组织对生长素的需求发生变化，导致生长素的自给或自养，出现驯化现象。一般1年以上或10代以上出现。生理因素导致的形态发生能力下降可通过改变培养条件而恢复。1.3.2 愈伤组织再分化 愈伤组织生长过程中，开始细胞分裂局限在外层细胞，当表面细胞分裂逐渐减慢

44、并停止时，内部较深处的细胞才开始分裂，且分裂的方向也发生改变，形成了维管化组织和瘤状结构，这是愈伤组织生长的一个共同特征。很多情况下，它们往往变成生长中心，但不进一步分化，并从它们的周围产生薄壁细胞，结果形成一种“泡沫球”增殖物，这仍然是生长活跃的愈伤组织的特点。随后这些小疣状物可以经历另一个发育过程，出现器官分化和体细胞胚状体的发生。在愈伤组织的培养过程中细胞分化的程度和类型有相当大的可变性。很难找到由完全一致的实质细胞组成的均一的愈伤组织。当形成导管元件、筛管元件、栓化细胞、分泌细胞等时就发生了细胞分化。一些分裂的细胞形成拟分生组织或维管节结，以后它们将变成芽顶点、根原基或初始胚形成的中心

45、。xylem tissuemeristematic activityunorganised tissue再分化途径器官发生途径：愈伤组织先产生芽（或根），再在另一种培养基上产生根（或芽），然后形成完整植株。胚状体发生途径：愈伤组织形成胚状体，再在另一种培养基上同时发展成带有根的苗。也叫无性胚胎发生（无性系）。胚状体是指愈伤组织中形成的与种子中胚相似的具有苗端和根端的双极性结构。也叫体细胞胚。 1.3.2.1 器官发生先形成芽，后在芽基部长根。先形成根，后在根基部形成芽。在愈伤组织的不同部位分别形成芽和根，然后根、芽的维管束接通形成完整植株。仅形成芽或根。如茶树花粉愈伤组织往往只能形成根。Sho

46、ot (caulogenesis) (a) and root development (b & c) on callus of Hypoxis1.3.2.2 体细胞胚胎发生起源：合子胚是配子细胞融合的产物，即受精卵；对体细胞胚而言（合成的无性胚）融合是不需要的。形态：一个完全发育的胚是具有两极的轴，一端是芽分裂组织，另一端是根分裂组织；也可以根据一种特殊类型的叶片子叶来辨别。进化：胚胎发育有连续的典型形态阶段（球形胚、心形胚和鱼雷胚）。 体细胞胚胎的特征：体胚最根本的特征是具有两极性。即在发育的早期阶段从方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都是单向极性。体胚的维管组织与外植体的该组

47、织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往住总与愈伤组织的维管组织联系。体胚的维管组织的分布是独立的Y字形，而不定芽的维管组织则无此现象。Typical morphological stages during embryo development: (A) globular, (B) heart shaped, (C) torpedo体胚发生的方式体胚发生的方式分为直接发生和间接发生两类。直接发生是指体胚直接从原外植体的胚性细胞不经愈伤组织阶段发育而成；而间接发生是体胚从愈伤组织或悬浮细胞、有时也从已形成的体胚的一组细胞中发育而成。多数体胚是间接发生。直接发生胚性细胞：与分生组织细胞类似，通常较

48、小，近圆形，具有较大的核和核仁并能高度染色，胞质浓厚，可直接发育成体细胞胚胎。如柑橘的珠心组织、茶树和龙眼的子叶、香雪兰的花序等外植体。间接发生胚胎发生丛（EC）的形成：EC是愈伤组织中一种液泡小、胞质浓的小细胞聚集成的丛状结构。其表面是高度分生组织化的细胞团，每个表面细胞都可能发育成胚状体。EC原培养基上不能使其表面的胚状体发育，但可增殖、崩溃而不衰。EC在转入降低或去除生长素、降低还原氮的培养基后，才能完成胚状体的发育。人工种子合成或人工种子是独立包埋的体细胞胚。通常术语“embling”用来描述从人工种子发育而来的植株。通常用海藻酸钠作为人工种子的包埋剂。也发展了用新的自裂胶珠的方法。直

49、到现在人工种子的质量和保真度仍然是人工种子产品发展和大量生产的制约因素。1.4 植物组织培养的基本程序无菌外植体的获得初代培养物的建立形态发生和植株再生培养产物的观察记载1.4.1 无菌外植体的获得外植体携带有各种微生物，这些微生物一旦进入培养容器，会造成培养基和培养材料污染，实验无法进行。所以，污染是组织培养的一大障碍，需要利用各种灭菌剂进行外植体的灭菌。不同器官的灭菌方法茎尖、茎段、叶片根、块茎、鳞茎花蕾果实、种子1、茎尖、茎段、叶片的灭菌清水冲洗（茸毛较多的先用皂液洗涤），吸水纸吸干。0.10.2氯化汞浸泡210min；或70酒精浸数秒，再在10次氯酸钙浸泡520min（或21530mi

50、n）。无菌水冲洗35次，吸干。适当切块，接种。2、根、块茎、鳞茎的灭菌带土，易损伤。仔细刷洗，切除损伤部位，增加灭菌时间或浓度。0.10.2氯化汞浸泡512min；或70酒精浸数秒，再在610次氯酸钙浸泡520min。3、花蕾的灭菌花蕾中的花药处于无菌状态，采摘后可直接灭菌。70酒精浸1030s， 0.1氯化汞浸泡310min（或1次氯酸钙1020min）。4、果实、种子的灭菌有些表面具茸毛或蜡质，需加吐温-80。果实：70酒精浸数秒，2次氯酸钙1020min。种子： 0.10.2氯化汞浸泡510min（或10次氯酸钙2030min）。1.4.2 初代培养物的建立无菌环境：外植体、培养基、接种

51、器械、接种工作台。规范操作：无菌操作合适条件：培养基、激素、其他添加物、外植体、培养条件等。抗生素的使用外植体灭菌是表面灭菌，无法除去侵入组织内部的微生物。有时可以考虑在培养基中加入抗生素。抗生素对植物生长可能有抑制作用，需摸索其合适的种类和浓度。注意添加方式，一般不能高压灭菌，有些需要过滤除菌。1.4.3 形态发生和植株再生 体细胞胚 植株外植体（愈伤组织） 具根、茎的两极器官 植株 器官分化 单极器官 先茎后根 植株 先根后茎 植株1.4.4 培养产物的观察记载愈伤组织诱导率产生愈伤组织的外植体数/外植体总数*100胚状体诱导率产生胚状体的外植体数/外植体总数*100芽分化率产生芽的外植体

52、数/外植体总数*100发根率发根芽数/培养芽数复习思考题：简述植物细胞全能性的概念。什么是植物细胞脱分化和再分化？愈伤组织是如何形成和生长的？植物离体培养中再生植株有哪些途径？何谓植物体细胞胚胎？其发生有哪些途径？影响植物离体形态发生的因素有哪些？为什么愈伤组织诱导一般选用固体培养基？愈伤组织的形成时期及特点。简述继代培养的原因及要点。体细胞胚胎的特征及发生方式。4 植物器官培养植物器官培养是指对植物某一器官的全部或部分或器官原基进行离体培养的技术。根、茎、叶、花器、果实、种子。4.1 根的培养根系生理代谢研究的良好实验体系；研究器官分化、形态建成的良好体系；建立根无性系，用于制药；诱变育种。

53、4.1.1 离体根的培养方法固体培养法：平放液体培养法：振荡固体液体双层培养法：根段形态学上端插入固体培养基，下端朝上浸露在液体培养基中。其他特殊方法4.1.2 离体根所用培养基WhiteMS、B5等大量元素减半或减2/34.1.3 影响离体根生长因素基因型营养条件：氮源、碳源、微量元素、维生素B1激素：生长素pH光照和温度：一般黑暗有利于根的形成。4.2.1 茎段培养植物茎段培养是指对植物的带有一个以上定芽或不定芽的外植体（包括块茎、球茎、鳞茎在内的幼茎切段）进行离体培养的技术。4.2 茎段和茎尖培养茎段培养的目的进行植物的离体快速繁殖。研究茎细胞的分裂潜力和全能性。诱导细胞变异和突变体的获

54、得。茎段培养的特点和优点特点：以芽生芽的方法进行增殖。优点：容易成功、变异小、性状均一、繁殖速度快。茎段培养产物单苗（芽）丛生苗（芽）单生芽和丛生芽的增殖方式适宜植物的离体快速繁殖。完整植物愈伤组织影响因素基因型激素配比：生长素、细胞分裂素4.2.2 茎尖培养茎尖培养（shoot tip culture or apical meristem culture）是指对植物顶端的原分生组织和它衍生的分生组织的培养。材料茎尖分生组织培养：1mm(带有12个叶原基的生长锥），可去毒。普通茎尖培养：几毫米至几十毫米的茎尖、芽尖及侧芽培养。Shoot tip culture 茎尖培养的一般方法材料制备：精心

55、预处理严格灭菌小心取材：体视显微镜、解剖针茎尖培养注意事项取材大小：脱毒小于1mm，快繁可数毫米。茎尖微小趋向于形成愈伤组织。培养基：多为MS，避免2,4-D（促使外植体愈伤组织化）。茎尖分生组织培养与脱毒普通茎尖培养与繁殖技术无菌物的建立芽的增殖中间繁殖体的增殖诱导生根移栽概念：Micropropagation生长状态及原因生长太慢：茎尖不见明显增大，但颜色转绿。进入休眠生长素太低温度低生长过旺：茎尖明显增大，基部产生愈伤组织，茎尖难于伸长，色泽较淡。生长素偏高用了2,4-D光照太弱温度过高生长正常：茎尖逐渐转绿，基本逐渐膨大，有时形成少量愈伤组织，茎尖逐渐伸长，最终形成小枝。影响茎尖微繁的

56、因素基因型外植体的大小供试植株的生理状态芽的着生部位褐变玻璃化极性后生变化形态发生能力遗传稳定性4.3 叶的培养离体叶：叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶等叶组织。意义：研究叶形态建成、光合作用、叶绿体形成等；叶细胞全能性；原生质体融合；无性繁殖系；诱变育种。影响叶组织培养的因素基因型细胞分裂素细胞分裂素和生长素的组合供试植株的发育时间和叶龄叶脉极性损伤离体叶组织发育途径直接产生不定芽由愈伤组织产生不定芽胚状体其他将镊子、解剖刀置于含有70酒精的清洁瓶内。叶片浸于该液1分钟作表面消毒。将叶片置于10漂白粉水溶液中（1/4杯漂白粉+2 杯水+几滴洗洁精）10分钟，并不时用镊子搅动。如果叶片浮在水上，

57、则需用镊子夹入水底。10分钟后，将漂白粉水溶液中的叶片转移到盛有无菌水的瓶子内，一次放入一片。将叶片转移到消毒过的盘上准备切割。切去叶的边缘，再将剩下的叶片切成24片，并分别将它们接入紫罗兰培养基上。经消毒的非洲紫罗兰叶片切成0.5-1英寸宽，接种于新鲜的培养基上。3周后叶片周围及表面肿胀，并有芽生成。芽伸长成苗。有时叶片表面都被诱导的芽所包围。接种56周后将接种的叶片1分2，并转入无激素的培养基中以利于苗的生长及生根。一个即将用于移栽的生根的紫罗兰试管苗。移栽到土壤中的小苗的前几天要用塑料袋罩上，直到小苗适应低湿度的环境。复习思考题植物根培养主要有哪几种方法？什么是茎段培养？有何特点及用途？

58、何谓茎尖培养？有何类型？需注意什么？叶培养有哪些意义？4 植物器官培养植物器官培养是指对植物某一器官的全部或部分或器官原基进行离体培养的技术。根、茎、叶、花器、果实、种子。4.1 根的培养根系生理代谢研究的良好实验体系；研究器官分化、形态建成的良好体系；建立根无性系，用于制药；诱变育种。4.1.1 离体根的培养方法固体培养法：平放液体培养法：振荡固体液体双层培养法：根段形态学上端插入固体培养基，下端朝上浸露在液体培养基中。其他特殊方法4.1.2 离体根所用培养基WhiteMS、B5等大量元素减半或减2/34.1.3 影响离体根生长因素基因型营养条件：氮源、碳源、微量元素、维生素B1激素：生长素

59、pH光照和温度：一般黑暗有利于根的形成。4.2.1 茎段培养植物茎段培养是指对植物的带有一个以上定芽或不定芽的外植体（包括块茎、球茎、鳞茎在内的幼茎切段）进行离体培养的技术。4.2 茎段和茎尖培养茎段培养的目的进行植物的离体快速繁殖。研究茎细胞的分裂潜力和全能性。诱导细胞变异和突变体的获得。茎段培养的特点和优点特点：以芽生芽的方法进行增殖。优点：容易成功、变异小、性状均一、繁殖速度快。茎段培养产物单苗（芽）丛生苗（芽）单生芽和丛生芽的增殖方式适宜植物的离体快速繁殖。完整植物愈伤组织影响因素基因型激素配比：生长素、细胞分裂素4.2.2 茎尖培养茎尖培养（shoot tip culture or

60、apical meristem culture）是指对植物顶端的原分生组织和它衍生的分生组织的培养。材料茎尖分生组织培养：1mm(带有12个叶原基的生长锥），可去毒。普通茎尖培养：几毫米至几十毫米的茎尖、芽尖及侧芽培养。Shoot tip culture 茎尖培养的一般方法材料制备：精心预处理严格灭菌小心取材：体视显微镜、解剖针茎尖培养注意事项取材大小：脱毒小于1mm，快繁可数毫米。茎尖微小趋向于形成愈伤组织。培养基：多为MS，避免2,4-D（促使外植体愈伤组织化）。茎尖分生组织培养与脱毒普通茎尖培养与繁殖技术无菌物的建立芽的增殖中间繁殖体的增殖诱导生根移栽概念：Micropropagatio