齐鲁医学慢病毒颗粒制备和应用

来自GeneCopoeia的慢病毒颗粒制备和应用GeneCopoeiaTM

4006020200唐珍洁zhenjietang@GeneCopoeiaInc.

日本Riken：

2004年1月-4月，为Riken提供1600个人类基因克隆构建。Roche：2006年4月-2007年3月，合作完成13000个人类基因克隆的无细胞体系蛋白表达。NCBI：2009年成为NCBI推荐克隆供应商。中国科学院广州生物医药与健康研究院：2006年5月至今，慢病毒载体和哺乳动物载体干细胞相关基因表达克隆构建，华南地区特种疾病相关胚胎干细胞库的建立。美国NIH（美国国家卫生研究院）：2007年7月-2008年1月，3000个斑马鱼克隆构建。美国Novartis（美国诺华制药）：2009年10月，美国诺华制药签约长期基因克隆供应商。2021/9/302生命奥秘电子杂志2008年创刊，现已出版45期，拥有近30万名读者。一直关注最前沿资讯，关注内容包括疾病疗法、基因、蛋白、前沿技术等。2021/9/303诱导性多能干细胞肿瘤转移RNAimicroRNA&癌症染色质与干细胞分化p53细胞信号通路GFP基因调控人类基因组测序40年抗癌历程回顾蛋白动力学表观基因组蛋白质泛素化人类蛋白质相互作用生物标志物新型蛋白标签数量遗传学疫苗安全与研发展望新型疫苗载体睡眠机制丙型肝炎抗肿瘤血管生成疗法蛋白激酶与心血管疾病HIV个性化用药人类基因疗法新一代DNA测序技术iPS技术光遗传学技术海量生物学生物信息学在癌症研究中的应用《核酸研究》生物数据库进展合成生物学转化医学组织工程与再生医学2021/9/304Outline体细胞定向重编程的研究思路慢病毒的构建原理慢病毒颗粒制备方法及应用2021/9/305ApplicationoflentivirusinsomaticreprogrammingVierbuchenT,etal.(2010)Directconversionoffibroblaststofunctionalneuronsbydefinedfactors.Nature463:1035-1041LijianH,etal.(2011)Inductionoffunctionalhepatocyte-likecellsfrommousefibroblastsbydefinedfactors.Nature475:386-389EdwardE.M,etal.(2011)HighlyEfficientmiRNA-MediatedReprogrammingofMouseandHumanSomaticCellstoPluripotency.Cellstemcell8:376-3882021/9/306ProtocolofDirectedReprogramming重编程因子的选择靶细胞的选择体细胞定向重编程重编程机制研究信号通路探讨终末细胞的筛选和鉴定+检测重编程效率终末细胞的功能指标检测2021/9/307ProfileDetection---qPCRArray2021/9/308ProfileDetection---miRNAqPCRArray包含有65个miRNAs,可用于检测干细胞的分化程度,同时也可筛选特异miRNAs用于体细胞重编程研究

http:///product/qpcr/mirna_array/2021/9/309miRNAqPCRValidatedPrimers人、小鼠、大鼠miRNA的Q-PCR引物都通过严格的实验验证/product/search/index.php?prt=22输入miRNAname、AccNo或Sequence等即可获得验证结果2021/9/3010Expressionofreprogrammingfactors

-------ORFexpressionclone基因的ORF表达克隆有6种表达体系，100多种载体；该克隆可直接用于表达2021/9/3011miRNA表达框已完全测序确证基于慢病毒载体系统的表达克隆可转染未分化细胞和难转化的细胞，获得与普通分化细胞类似的转染效率通过应用eGFP可以监测病毒和质粒载体的转染效率Expressionofreprogrammingfactors

-------miRNAclone2021/9/3012Pre-madelenti-vectorexpressionclone已经将约20,000条基因插入到慢病毒载体（Lv105）、哺乳动物载体（M02)等4套载体中，5个工作日即可交付使用。/product/clone/orf_clone_special_collection.php

2021/9/3013GeneGroups/Families/product/search/group/2021/9/3014Reserchofreprogrammingmechanism理解细胞正常的分化机制，可以更准确地运用各种重编程因子进行细胞转分化的操作。

http:///product/search/pathway/

2021/9/3015Reserchofreprogrammingmechanism2021/9/3016VirusvectorAdenovirusAAVLentivirusRetrovirusGeneExpressionTransientTransientorStableTransientorStableStableInfectDividingCellsYesYesYesYesInfectNon-DividingCellsYesYesYesNoIntegrationintoTargetCellGenomeNoNo*YesYesImmuneResponseinTargetCellsHighVeryLowLowModerateRelativeViralTiterXXXXXXXXXXXXRelativeTransductionEfficiencyXXXXXXXXXXXX*NativeAAVwillintegrate,butrecombinantAAVrarelydoes.2021/9/3017HIVViron慢病毒载体（LentiviralVector）主要是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因转移载体。2021/9/3018HIV&replication2021/9/3019Packagingmix

----------fourplasmidssystemCMVgagpolRREpolyAEF1αREVpolyACMVpolyAVSV-G包膜蛋白质粒包装质粒+2021/9/3020MammalianConstitutivepromotersQinJY,etal.(2010)SystematicComparisonofConstitutivePromotersandtheDoxycycline-InduciblePromoter.PLoSONE5(5):e106112021/9/3021PackagingsystemP2021/9/3022LentiparticlePackagingPlate293Tcellsfortransfection.Prepareplasmidmix+EndoFectinAddto293TcellsChangeMediumHarvestmedium(Viruses)LentivirustitrationLentiviruspurificationandconcentration.(optional)StoreLentivirusesinsingleusealiquotat-80°CDay1Day2Day4Day4-724-48hours20-30min4-6h48-72hoursaftertransfection2021/9/3023PackagingTransfection48hours1-100ms-48h2-100ms-48h3-100ms-48h2021/9/3024TitrationoftheLentivirusesFlorescentcolonycountingorFACScounting:Infectionunits(IU/ml)Resistantcolonycounting:Infectionunits(IU/ml)RT-qPCR:copynumberofthevirus,nottheinfectionunitCellsforLentivirustitration:Hela,HT1080,orH1299cells2021/9/3025TitrationoftheLentivirusin24-wellplates1--2.5x107U/ml2--1.8x107U/ml3--3.5x107U/ml0.1ul1--2.5x107U/ml1.0ul2--1.8x107U/ml3--3.5x107U/ml将慢病毒颗粒稀释成不同浓度(0.02,0.1,1.0and5.0ul)转染细胞48~72h后，在荧光显微镜下计数滴度=感染细胞数*病毒颗粒剂量2021/9/3026TitrationoftheLentivirusesFlorescentcolonycountingorFACScounting:Infectionunits(IU/ml)Resistantcolonycounting:Infectionunits(IU/ml)RT-qPCR:

copynumberofthevirus,nottheinfectionunitCellsforLentivirustitration:Hela,HT1080,orH1299cells2021/9/3027PurificationandConcentrationofLentiviruses1.TraditionalCsClultracentrifugation.3.Ionexchange:

ViraBind™Concentration&PurificationKits(CellBiolabs);Fast-TrapVirusPurificationandConcentrationKits(Millipore).4.Precipitation:

LentiPacTMLentivirusConcentrator(GeneCopoeia).Quickandsimpleconcentrationoflentiviralparticles(2-3hours).Increasetiter(IU/ml)by10X–100X.NoultracentrifugationisrequiredHighrecovery:>90%Pre-step:Filtration(polyethersulfone(PES)filters)orgeneralcentrifugation.

2.Ultrafiltration:usingfilter<0.01µM(200KD)2021/9/3028PurificationandConcentrationofLentiviruses(Cont.)A.Pre0.2ulB.Conc.4h0.02ulC.Conc.16h0.02ulFigure.ConcentrationofLentiviruses:GFPcontaininglentiviruses(2x107IU/ml)wereconcentrated10timesusingLentiDensandthentransducedtheH1299cellsin24-wellplates.Theimagesweretaken48