碳酸酐酶的研究进展

碳酸酐酶的研究进展

碳酸酶（ca，ec4.2.1）是一种含有zn2-4的金属酶。自1933年meldung和roughton发现牛的血红素以来，它不仅在所有动物组织和细胞中发现了钙，还在植物和细胞中发现了丰富的钙。CA对于许多真核生物的生理过程如光合作用、呼吸作用、CO2和离子运输、钙化作用和酸碱平衡等是必需的。虽然CA存在于真资助所以LTRPC2和LTRPC7是具有激酶活性和离子通道活性的生命功能的蛋白质。参考文献PutneyJWetal.Bioessays,1999,21:38—41HarteneckCetal.TrendsNeurosci,2000,23:159—核生物界所有高度进化的生物体中,但以前对来自古细菌界和细菌界原核生物的CA关注较少,自从1963年在NeisseriaSicca中首次确定存在CA以来,该酶仅从5种原核生物中纯化获得。最近的研究表明CA广泛存在于古细菌界和细菌界代谢多样化的原核生物种类中,这表明该酶在原核生物中的作用比先前所认识的更广泛和更基本。近年来对原核生物CA的研究引起了越来越多学者的关注。1.类ca的晶体结构及基因序列氨基酸序列比较和晶体结构分析表明CA可被分为三种不同的类别,分别被指定为α类、β类和γ类,它们之间没有显著的序列一致性,而且都是独立进化的。因此,CA类别是催化功能趋同进化的极好例子。α类CA是从5～6亿年前一个共同的原始基因进化而来的,是了解较多的一类162BloomquistBTetal.Cell,1988,54:723—728MontellCetal.Neuron,1989,2:1313—1317SanoYetal.Science,2001,293:1327—1330PerraudALetal.Nature,2001,441:595—599RunnelsLWetal.Science,2001,291:1043—1047NadlerMJetal.Nature,2001,411:590—595CA,分子量为29kD的单体,存在于所有哺乳动物、一些单细胞藻类以及很少的细菌界原核生物中。γ类CA是1994年在古细菌Methanosarcinathermophila中发现的,简称为“Cam”,分子量为69kD,是一个具有左手平行的β-螺旋折叠的同型三聚体,该类CA被认为是在30亿年至45亿年前进化来的。对β类CA的了解要远远落后于对α类CA的了解,直到2000年才报道了β类CA的第一个晶体结构。β类CA广泛分布于高等植物、多种藻类以及细菌界和古细菌界原核生物中,可能与α类CA的进化年代差不多。β类CA与其它两类CA具有显著的差异。首先,分子量比其它两类CA大得多,一般为100～200kDa,由23～25kDa亚基构成四聚体或八聚体。其次,从晶体结构可见三类CA在二级结构上的明显差异(图1)。第三,β类CA的晶体结构显示Zn2+与2个保守的半胱氨酸和1个保守的组氨酸连接在一起。系统发生分析表明β类比其它两类更多样化。序列对比显示仅有5个残基——3个Zn2+配基、1个天冬氨酸残基和1个精氨酸残基是完全保守的。近来获得的一些CA的晶体结构支持了这种多样性,例如来源于红藻(Porphyridiumpurprueum,图1B)、豌豆(Pisumsativum,图1C)的CA以及来源于古细菌界(M.thermoautotrophicum,图1D)和细菌界(Escherichiacoli,图1E)的原核生物的CA。令人惊奇的是,在P.purprueum和E.coli酶中的第4个Zn2+配基都是β类保守的天冬氨酸。P.sativum酶的Gln-51、Phe-179、Tyr-205残基在A-F进化枝中所有的真核CA和细菌CA中都是保守的,但在和M.thermoautotrophicum酶Cab同样的进化枝(进化枝G)中所有其它CA的序列中都没有这些残基。这个发现使得Kimber和Pai提出β类是由2个亚类组成的,即“植物型”(以P.sativum酶为代表)和“Cab型”(以M.thermoautotrophicum酶为代表)。这两个亚类在结构上的差异和对抑制剂的不同反应显示它们具有不同的机制。2.ca的结构类型CA主要催化CO2和之间的相互转化反应()。α、β和γ三类CA尽管存在总的结构差异,但它们的活性中心都含有一个催化所必需的Zn2+。动力学研究表明所有三类CA都遵循了一个相同的两步机制。第一步是Zn2+结合的氢氧根离子对CO2的亲核攻击(方程1),第二步是通过Zn2+结合的水分子的离子化和活性部位去质子而使活性部位再生(方程2)。在这个步骤中,Zn2+离子作为路易斯酸使水分子的pKa值从14下降到7.0。A:α类,人同工酶Ⅱ(4CA2),30.0kD;B:β类,P.purpureum(1DDZ),62.1kD;C:β类,P.sativum(1G5C),193.6kD;D:β类,M.thermoautotrophicum(1EKJ),75.6kD;E:β类,E.coli(1160),98.8kD;F:γ类,M.thermophila(1THJ),69kD大多数CA的kcat值大于104s-1,需要一个中间物——质子穿梭残基(protronshuttleresidue,PSR)将质子从Zn2+结合的水分子转移到外部缓冲液(B)中(方程3、4)。不同类别的CA对抑制剂的敏感程度不同。在细菌界,N.sicca的CA属α类,芳基和杂环基磺酰胺对其有强烈抑制作用;由E.coli的cynT基因编码的CA属β类,氰酸盐和乙酰唑磺胺对其活性半抑制浓度分别为0.1和0.005mM。在古细菌界,由M.thermoautotrophicum的开放阅读框架(ORF)编码的CA(简称Cab)属β类,是迄今发现的热稳定性最好的CA,在75℃保持15min活性仍不改变。Cab对乙酰唑磺胺和乙氧唑磺胺敏感,碘化物、硝酸盐和叠氮化物也是Cab有效的抑制剂,但是能抑制植物β类CA的阴离子如Cl-、等对Cab活性无影响。而Cam对磺胺类抑制剂和阴离子敏感。α类原核生物CA和哺乳动物CA一样具有一定的酯酶活性,如N.sicca的CA在催化以4-硝基苯基乙酸盐为底物的反应中,其酯酶活性为人CAⅡ活性的10%。β类和γ类原核生物CA和植物β类CA类似,尚未检测到酯酶活性。3.ca在原核生物类和类上的表达采用现在已获得的来自每一种α、β、γ类原核生物CA产生的抗血清,Smith等确定了原核生物内代表每一CA种类的范围。此外,基因组测序的出现允许从已完成的和尚未完成的原核生物的基因组序列中搜索编码假定CA的开放阅读框架。采用从AnabaenaecaA基因(α类)、M.thermoautotrophicumcab基因(β类)和M.thermophilacam基因(γ类)推导出来的氨基酸序列作为查询蛋白质而进行的BLASTp和tBLASTn搜索,识别了6个假定的α类、26个假定的β类和25个假定的γ类CA序列。目前分别在淡水、海洋、嗜温的、嗜热的、好氧的、厌氧的、致病的、共生的、嗜甲醇的、嗜乙酸盐的、产甲烷的、产乙酸盐的、自养的、异养的以及光合物种中获得了CA存在的证据。这些结果证明了与先前所认识的相比,CA不仅在原核生物中存在的范围更普遍,分布的物种的代谢多样性更丰富,而且β类和γ类在原核生物CA中占主导地位。事实上,α类CA仅在细菌界的少数微生物中检测到,在古细菌界却没有检测到。4.ca实现为2作诱导材料对已知的CA已提出了两条普遍的作用:(1)CO2或输送;(2)为酶反应提供CO2或。对光合微生物中CA的生理作用已作了大量的研究,一般认为CA在CO2浓缩机制中起着主要作用,在蓝细菌的原生质膜和羧化小体中都发现有CA活性。但是,CA在古细菌界和细菌界原核生物代谢中所出现的范围以及许多个体物种中包含一个以上类别CA的现象表明,CA在原核生物中的作用比先前所认识的要更广泛和多样化。这些结果暗示了CA在原核生物生理学上的新作用。下面将讨论CA在非光合原核生物中一些可能的作用。氰酸盐对E.coli有毒,但氰酸酶可催化氰酸盐分解成和CO2,使得氰酸盐也可用作唯一生长氮源,来自E.coli的氰酸盐诱导型CA(CynT)可将氰酸酶产生的CO2转换成,防止耗竭,为氰酸盐的进一步分解或其它代谢过程提供所需的。而且,cynTSX和cynT缺陷型突变株的实验结果表明CA可提供一些保护来抵抗氰酸盐产生的生长抑制。许多产乙酸菌在缺乏外源CO2的异养或自养条件下不能生长产乙酸,CA的作用可能是增加胞内CO2水平,类似于在蓝细菌中的作用,这种CO2浓缩机制可能对CO2用作唯一碳源和末端电子受体的情况更为重要。产乙酸菌CA的其它作用还包括调节胞内pH以及与乙酸盐/转运蛋白相偶联。CA在非光合原核生物的CO2固定中亦发挥了重要作用。例如草酰乙酸的合成在甲烷古细菌M.thermoautotrophicum的CO2固定途径中是一个重要反应,M.thermoautotrophicum含有两种酶来完成草酰乙酸的合成,即丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧化酶,是这两种酶的底物,而CA提供给这两种酶,以保证这两种酶附近有足够的积累。CA除了为酶反应提供CO2/外,还可以通过移去CO2/来推动反应产生能量,这对于与能量产生相偶联的脱羧反应而言可能特别重要,可以认为CA通过将CO2转换成移去脱羧反应产生的CO2,从而推动脱羧反应的进行。在原核生物代谢中CO2无所不在,这暗示着原核生物可能利用CO2作为工具,通过CA催化不带电的CO2与带电的的相互转化来行使各种生理功能,如溶质运输。数据库检索确认了三个可能编码双功能蛋白质的序列(S.coelicolorSC2,M.bovisMB3和M.tuberculosisMT3),这些序列编码可能的跨膜蛋白质,其N-末端部分与低亲和力的硫酸盐转运蛋白相类似,而C-末端区域与β类CA相类似。因此,CA可能利用同向转运或反向转运机制在化合物的输送中起作用。除了催化CO2和的相互转化外,CA还可催化一些其它的反应,如乙醛的水化、羧酸酯和各种卤素衍生物的水解。据报道,酚酯、磺酸酯和磷酸脂可用作CA的底物。但是CA的这些功能只在研究α类人同功酶时得到确认,β、γ类CA是否也能催化这些反应尚不可知。最近有报道认为CA对碳酸盐岩的溶解具有催化作用,分别在石灰岩和白云岩的溶解实验中加入CA,结果发现,对于石灰岩,其溶解速率在高CO