利用反向遗传学方法敲除细胞基因

利用反向遗传学方法敲除细胞基因

丝虫菌占真菌世界的很大一部分，在工业、农业、医学和基础生物学研究中发挥着重要作用。一些重要的工业菌株用于生产酶、有机酸等物质,如黑曲霉、绿色木霉等。一些与农业生产有着重要的关系,既是重要农作物上的病原菌,如稻瘟病菌、棉花黄萎病菌等;又是生防真菌,具有防治植物病虫害的功能,如绿僵菌、木霉菌等。另一些丝状真菌在医药上有着举足轻重的作用,如来源于海洋的丝状真菌、一种新型的可以产生抑制癌细胞扩散物质的灰绿曲霉(Aspergillusglaucus)。同时,由于丝状真菌中的构巢曲霉(Aspergillusnidulans)和粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)基因组相对简单、可操作性强,可作为“模式”种用于真核生物的一些生物学特性研究。随着大量丝状真菌基因组序列的测定以及高效分子研究手段的发展,以基因功能鉴定为目标的功能基因组学已经成为目前生命科学领域研究的热点。目前已有一些方法用于丝状真菌基因功能的研究,如转座子标签法、基因敲除技术、RNA干扰、超表达及酵母杂交系统等。其中基因敲除技术能够有效和特异性地抑制目标基因的表达,操作简单易行,是构建许多真菌基因突变体的首选技术,故应用十分广泛。1995年PaulBundock首次应用农杆菌实现了对酿酒酵母的转化,1998年deGroot等构建了农杆菌介导(Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformation,ATMT)丝状真菌转化体系。该方法操作简单、受体范围广、转化效率高、单拷贝率高及突变体遗传稳定,解决了传统转化方法的瓶颈。农杆菌介导的遗传转化方法已是目前实现真菌遗传转化应用最广泛的方法之一。利用该方法成功转化的真菌已有100种,而且已有多种真菌利用该方法构建了含丰富类型转化子的突变体库,通过突变体表型来筛选特定的基因。另外,随着真菌基因组测序的完成,使得ATMT结合反向遗传学的方法定向分析基因的功能成为了可能。1基因打靶技术基因敲除技术是20世纪80年代末发展起来的一种研究基因功能的新型技术。此后经历了将近20年的推广和应用,直到2007年10月8日,美国科学家Capecchi和OliverSmithies、英国科学家Evans因为在利用胚胎干细胞对小鼠基因进行定向修饰原理方面的系列发现分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖,基因打靶技术才获得诺贝尔奖评审委员会的关注和肯定。早在1973年,Mishra等首次报道了丝状真菌粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)的DNA转化现象,他们用野生型菌株的总DNA处理肌醇缺陷型菌株,获得了肌醇原养型转化菌株,但受到质疑;因为在当时普遍认为真核生物发生转化几乎是不可能的,上述实验的结果有可能是由于回复突变造成的。Mishra改进了设计,用含有温度敏感肌醇等位基因突变菌株的DNA来处理肌醇缺陷型菌株,得到了温度敏感转化菌株。随后,Case等证实DNA介导的粗糙链孢霉遗传转化,在转化子中含有整合于染色体上的质粒DNA片段。此后据不完全统计,已有超过100种丝状真菌实现了转化(表1)[20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31]。2关于丝状真菌基因的提取技术的研究2.1基因缺失修饰基因敲除(Geneknockout)又称基因打靶(Genetargeting),是对序列已知但功能未知的基因,从分子水平上设计实验,将该基因去除或用其它顺序相近的基因取代,根据宿主的形态、生理生化特性等的变化来推测相应基因的功能。绝大多数的基因敲除策略都是基于同源重组(Homologousrecombination,HR)机制。利用此技术可以在分子水平上将目标基因进行定向修饰,包括基因失活、引入点突变、缺失突变和插入外源片段等,并可将修饰后的遗传信息在生物体内表达,从而通过表型的变化揭示目标基因的功能。目前已有多种真菌构建了含丰富类型转化子的突变体库。2.2同源序列双交换现象通过同源重组(HR)整合外源基因的效率在不同种甚至不同菌种之间是不同的。目标整合依赖于目标基因两端与选择标记基因两端的同源序列之间双交换(图1)。基因同源重组现象首次在哺乳动物细胞中证实存在,这为基因敲除技术的创立奠定了理论基础。之后近20年来,此技术已经由在酵母和哺乳动物中的应用,拓展到了植物、真菌基因功能研究中,主要包括敲除载体构建、敲除载体的真菌转化、转化子筛选和目的敲除转化子鉴定等。2.2.1in-sfson克隆技术敲除载体由四部分组成,包括与靶序列两端同源的同源臂序列(HRS1和HRS2),中间的筛选标记基因序列以及载体序列。大多数已报道的对目的基因进行研究的方法都基于传统的克隆策略来构建敲除载体,包括体外转座子突变、酶切连接、FusionPCR、Split-marker-basedATMT等方法。在利用这些方法构建敲除载体的过程中,由于需要多步克隆,或者受酶切位点的限制等因素,构建载体费时费力。随着生物学的发展,对于重组片段的组合,形成了多种新型技术,克隆只需一步完成,主要包括In-Fusion克隆技术和USER(Uracilspecificexcisionreagent)克隆技术。In-Fusion依赖于In-Fusion酶3′-5′外切酶活性,关键技术就是在进行PCR两端引物设计时,在目的基因同源序列的两侧分别加入与线性化载体两端相同的碱基各10~15个,这样经过Polymerasechainreaction(PCR)得到的产物两端就分别带上了10~15个和载体末端重复的序列,加入In-Fusion酶后就可以实现类似同源重组的反应,将PCR产物“置换”到目标载体上。该方法不需要借助任何限制性内切酶、连接酶,或者磷酸化、补平末端等手段,就可以将任何PCR产物片段精确定向克隆到目的载体上,并且克隆的位置不受酶切位点的限制。另外,该方法对载体没有特别的要求,任何自备的载体都可以使用。另一种技术USER克隆对载体则有特殊的要求。USER体系依赖于USER酶,是一种特异性切割尿嘧啶的酶,是尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和核酸内切酶VIII(一种DNA糖基化酶-裂解酶)的混合物。UDG催化尿嘧啶碱基的切除,形成一个脱碱基(脱嘧啶)位点,但同时保持了磷酸二酯键骨架的完整性。核酸内切酶VIII的裂解酶活性则分别在脱碱基位点的3′端和5′端裂解磷酸二酯键骨架,释放五碱基的脱氧核糖。磷酸二酯键断裂后,DNA两端形成3′突出端,即USER克隆位点(USERcloningsites,UCSs)。当将载体与经过USER酶处理过的PCR片段混合时,便会组装成一个重组分子。相对In-Fusion方法,USER克隆整合效率要高很多,大概为80%(而In-Fusion整合效率为10%~20%)。2.2.2受体材料的选择丝状真菌的DNA转化方法主要有原生质体转化、基因枪转化、限制酶介导的遗传转化和根癌农杆菌介导的转化法等。其中农杆菌介导遗传转化具有受体材料范围广、转化效率高、转化子能够稳定遗传、DNA多为单拷贝插入等不可比拟的优点,因此在丝状真菌研究中应用较为广泛。周芳芳等利用农杆菌介导转化(ATMT)的方法,构建了含2000个转化子的棉花黄萎病菌强毒菌株Vd080的突变体库,并对转化体系进行了优化;研究证实,200μmol·L-1的诱导剂乙酰丁香酮(AS),25℃共培养48h,转化效率达每106个孢子有150~540个转化子。2.2.3同源重组的检测在基因敲除过程中,转化子筛选是一个技术难点。虽然借助农杆菌介导的遗传转化极大地提高了转化效率,但是由于T-DNA自身的性质,它会随机整合到基因组中,造成T-DNA随机插入转化子和同源双交换产生的基因敲除转化子都带有同样的选择标记而难以区分。而且等位基因同源重组的效率相对T-DNA随机插入的效率低很多,造成基因敲除转化子的数量远远少于随机插入的转化子,往往需要筛选大量转化子才能得到基因敲除的转化子。通过基因重组进行基因敲除要求已知靶基因两端的侧翼序列,但不同生物中所要求的侧翼序列长度不同。在酿酒酵母和裂殖酵母中,同源序列为50~100bp即可实现同源位点的基因替换,同源重组效率可达到50%~100%;而丝状真菌通常需要1kb甚至更长的同源序列,重组效率才能达到10%~30%。而且,丝状真菌中靶序列与载体上所带序列的相似性需接近100%。不同菌株相似序列内些许变化都可能造成同源重组失败。Maier等研究了同源序列长度对尖孢镰孢菌转化和同源重组率的影响,结果显示,当同源序列长度为800bp时,同源重组率可达到93%以上;同源长度为500bp时,同源重组率为70%;而当同源片段长度小于400bp时,同源重组率还不到10%。因此在构建敲除载体时需根据不同的菌株选择合适的同源片段的长度。随机插入和同源重组转化子都含有抗性基因,是转化子筛选的难题。为解决该问题,现在研究人员在敲除载体中加入特殊的结构元件或采用特殊的报告基因来提高筛选效率。田李等在农杆菌T-DNA之间除了加入同源重组DNA片段,还加入了致死基因单纯疱疹病毒胸苷激酶(Herpessimplexvirusthymidinekinase,HSVtk),该致死基因可以使T-DNA转化子不能存活,反过来即提高基因敲除转化子的比例,成功构建了敲除载体Pko-ADE4和Pko-chsv,基因敲除转化子的比例分别达到了87%和44%,大大提高了目的敲除转化子的比例。Mansour等在小鼠胚胎肝细胞进行基因敲除试验中首先采用了正负筛选策略,正选择标记可以筛选出发生重组的转化子,负选择标记排除发生非同源重组的转化子。Takahashi等将这种方法用于酱油曲霉,由此推测这一技术也适用于其它丝状真菌。Maier等以失活聚酮合酶基因PKS12为选择标记基因,由于失活的pks12基因的菌株会发生白化现象,建立了禾谷镰刀菌的高效敲除体系,同源重组率可达到93%以上。在转化过程中,外源基因整合到受体染色体上时,主要有两种重组途径涉及到双链DNA破坏修复(DSBs),即同源重组(HR)途径和非同源末端连接(Nonhomologousendjoining,NHEJ)途径。前者主要依赖于同源片段,后者不需要同源片段即可整合到宿主细胞染色体上。另外,在人类细胞中,NHEJ途径受特异蛋白因子如DNA依赖型蛋白激酶、Ku70、Ku80以及DNA连接酶IV-Xrcc4复合物的影响,这些影响因子在真菌和人类细胞中相对保守。因此一种解决重组效率低的方法是构建失活NHEJ菌株。有报道称,Ku70缺失菌株同源重组率几乎接近100%。然而,JieFeng等构建了叶枯病菌颖枯壳针孢Ku70缺失菌株,并证实与野生型相比,缺失菌株同源重组率显著提高,但并不像先前报道的那么高。FangZhe等构建了ligD缺失突变体,证明同源重组率由原来的不到2%上升到85%。但总体来说,构建NHEJ缺失菌株确实比野生型菌株同源重组率高。综上所述,对目的敲除转化子进行筛选主要有以下几种方法,常规的同源重组交换(即不需要对受体菌及载体做任何特殊的处理),对受体菌进行改造(即将敲除掉KU70/KU80等阻断NHEJ途径的基因的内生真菌作为受体菌),敲除载体中加入致死基因(即在敲除载体中加入1个致死基因,如HSVtk,来提高筛选率)和表型筛选(即敲掉某表达表型的基因后,通过表型的变化来对转化子进行筛选)。从表2可以明显看出,其它3种方法都要比常规的HR方法重组率要高得多,对于采用哪种方法最好,并没有绝对的说法,研究者需根据内生真菌的性质以及敲除基因的表型等进行选择。2.2.4转化子的确定3基因功能研究在丝状真菌研究中,功能验证的研究方法各有优缺点,基因敲除是以同源重组为理论基础的先进的转基因技术,具有整合位点单一、精确等优点。但是基因敲除可能导致某基因功能的缺失,但生物体可能存在某些代谢补偿途径,使敲除表型被掩盖或发生变化,因此,仅仅从最后表型判断有时并不能从本质上揭示某基因的功能。任何一种基因功能研究方法可能在某一个体系效果较好,在另一个体系较差。采取哪一种方法主要取决于实践经验、不同物种及研究目标,因此要全面系统地研究某一基因的功能,通常需要尝试应用多种技术体系。越来越多的丝状真菌测序的完成及现代分子生物学手段的快速发展,基因功能的研究逐渐成为研究热点,研究者在工作中,改进和发展了多种高效敲除基因的手段。相信在不久的将来,农杆菌介导的遗传转化基因敲除技术广泛使用,对基因功能的研究将会变得更加快速全面高效。对转化子的鉴定,通常使用的方法有分子鉴定和表型观测。分子鉴定是使用选择标记基因引物和目标基因引物扩增来验证转化子或者以目标基因为探针进行Southern杂交来鉴定转化子。表型验证是观察野生型与突变体表型,或者构建互补载体,得到互补突变体,观察野生型和互补突变体表型最终验证目标基因的功能。田李等构建了ADE4(腺嘌呤合成酶基因)和ChsV(几丁质合成酶基因)敲除突变体,采用分子生物学证据,即分别以野生型菌株和转化子菌株基因组为模板,潮霉素抗性基因HPH引物和目的基因引物同时PCR扩增,结果表明野生型只能扩出目的基因一条带,阳性转化子只能扩出HPH一条带,而非阳性转化子则可以同时扩出HPH和