亚硫酸盐处理木质纤维素产生的废液中生物抑制剂的快速测定

亚硫酸盐处理木质纤维素产生的废液中生物抑制剂的快速测定

由于木材纤维的原料制备的燃料乙醇通常需要预处理、酶分解和发酵，其中预处理是提高纤维素酶分解效率的一项重要技术。酸性亚硫酸盐预处理因具有纤维素水解率和得率高、木素易回收利用等特点,近年来受到广泛的关注。酸性亚硫酸盐过程中,木素经磺化、降解等反应后,主要以木素磺酸盐的形式溶解于废液中;部分半纤维素水解成单糖后,进一步降解成糠醛和羟甲基糠醛(HMF)。这些副产物能抑制酶的活性或微生物的生长,因而被称为“生物抑制剂”。监测生物抑制剂的生成对预处理的优化控制具有重要意义。已有报道UV光谱法可同步测定木素和糠醛类物质,但由于这些物质对紫外光有强烈吸收,该法需要对试样进行稀释。衰减全反射(ATR)-UV光谱法可对试样进行直接测定而无需稀释,已用于同步检测硫酸盐制浆废液中的硫化物、有效碱、可溶解木素和总溶解性固形物。本文建立了同步测定木素磺酸盐、糠醛和HMF的ATR-UV光谱分析法,并将其应用于桉木亚硫酸盐废液的分析。1实验1.1桉木亚硫酸盐废液的制备桉木木片由广东省雷州市林业局提供。经筛选后,木片的规格为长15～30cm,宽15～20mm,厚3～5mm。在使用前,密封保存在-18℃的冰柜中。木素磺酸盐是用超滤法从桉木亚硫酸氢钠预处理废液中纯化而得。预处理条件为:NaHSO3用量3%(w/w),H2SO4用量0.2%(v/v),最高温度170℃,保温时间30min,液比3∶1。预处理完成后,使用NaOH溶液调节桉木亚硫酸盐废液的pH值至5～6并过滤。然后将滤液稀释10倍,泵送入Millipore超滤系统(Amicon,US)。收集截留分子量10～50ku的级分,并使用旋转蒸发仪将其浓缩至浓度80g/L以上。使用液氮对浓缩液进行急冻,然后再冷冻干燥至水分低于0.5%。糠醛和羟甲基糠醛均为购自Sigma-Aldrich公司(St.Louis,MO)的分析纯试剂。其他试剂均购自广州化学试剂厂。1.2hso4密度用于建立光谱分析方法而进行的预处理条件为:NaHSO3用量4%(w/w),H2SO4(浓度98%,密度1.84g/mL)用量0.2%(v/v),液比3∶1,升温时间40min,最高温度160～180℃。预处理在Parr4848型间歇式压力反应釜中进行,在保温阶段每5min取样一次。1.3atr传感器的光学特性ATR传感器使用一个0.2mm×20mm×65mm的石英板作为内部反射元件,其折光率为np,远高于周围介质的折光率(ns)。光从与石英板边缘呈锐角θ的方向射入,到达石英板与介质的边界后发生反射。在每一个反射点,总会有一部分光透过边界被介质吸收,内部反射光逐渐衰减,并由分光光度计记录衰减的强度。ATR-UV吸收光谱的一次透光率(T)符合朗伯比尔定律:Τ=ΙΙ0=Exp(-ε⋅C⋅be)=Exp(-a),(1)T=II0=Exp(−ε⋅C⋅be)=Exp(−a),(1)其中,I和I0分别是样品与空白的光谱强度,ε是吸光系数,C是待测样的浓度,be是有效光程长。与普通的UV吸收光谱不同,ATR光谱中的有效光程(be)由入射光波长、介质折光率、入射角等多个因素决定,其中介质折光率起主要作用。介质的折光率又决定于测试温度、吸光和非吸光物质的浓度。如果忽略反射造成的光强度损失,ATR传感器z次反射的透光率可以写成下式:Tz=[Exp(-a)]z=Exp(-za)=Exp(-z·ε·C·be)。(2)ATR每次反射的光程长约为1～2μm,通过改变反射次数可以调节有效光程长,并提高ATR的灵敏度。借用普通UV吸收光谱中吸收值的定义,z次反射的ATR光谱吸收值可以写成与物质浓度c成正比的形式:aΖAΤRZATR=-LnTz=za=z·ε·C·be。(3)需要说明的是,be主要取决于介质的折光率,由待测物质的浓度决定,因此,当浓度范围过大,浓度过高时,不能得到吸收值与浓度的线性关系。对于多组分样品,在特定波长(λ)下,ATR吸收值可看成由各组分吸收值的线性加和,Aλ=k·z[(ε1C1+ε2C2+…+εnCn)·be(C1,C2,…,Cn,λ)]。(4)生物抑制剂的标准溶液以及亚硫酸盐预处理废液通过一个Teflon管(总体积约1.2mL)泵送进入ATR传感器,使用Agilent8453型UV-Vis分光光度计记录ATR-UV光谱(波长范围200～400nm)。本文所列出的光谱强度均为3次测试所得的平均值。2结果与讨论2.1atr-uv光谱检测糠醛、HMF和木素磺酸盐的ATR-UV光谱如图1所示。糠醛和HMF分别在230nm/280nm和230nm/286nm处有两个吸收峰,它们在280nm附近吸收值比230nm处大得多。木素磺酸盐在230nm处有吸收较强的肩峰,在280nm处的吸收峰较弱且平坦。与木素磺酸盐相比,桉木亚硫酸盐废液的ATR-UV光谱在230nm和280nm处吸收较强,并且280nm处的吸收峰向长波长方向移动,这些特征表明废液中含有糠醛类物质。无机盐类物质也可能引起ATR-UV光谱吸收的增强。在酸性亚硫酸盐过程中,主要的无机盐离子是Na+、H+、HSO3-、SO32-和SO42-,但只有HSO3-、SO32-在常用的浓度范围内会引起光谱吸收的明显增强。图1表明,HSO3-和SO32-在紫外区200～210nm有显著吸收。由于糠醛和HMF在短波长紫外区域(波长<230nm)几乎无吸收,可用215nm处的光谱强度进行木素磺酸盐的定量分析。2.2表面活性剂对酸性体系中木素的吸附ATR传感器与石英比色皿对紫外光的折射率是一样的,因此,可以将其看成是光程长约为1～2μm的“超薄”比色皿。但随之而来的问题是,任何物质在ATR传感器上的吸附都可能造成测量的误差。图2显示了木素磺酸盐在酸性(pH2)条件下的动态吸附。在20min内,木素磺酸盐在ATR石英板上吸附层的浓度随时间持续增加,因此,ATR-UV光谱法不适宜直接测定酸性体系中的木素含量。加入表面活性剂(图2a)或NaOH(图2b)可有效解决这个问题。(a)加入十二烷基磺酸钠图2a显示加入阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠(SDS)后,木素磺酸盐在ATR传感器表面的吸附层浓度显著下降。当SDS用量超过100mg/L时,吸收值在1min后趋于稳定;当用量超过500mg/L时,SDS几乎可以完全阻止木素磺酸盐的吸附。图2b显示加入适量的NaOH使木素磺酸盐的pH稳定在6～8之间也可以消除木素磺酸盐吸附对测量产生的影响。由215、230和280nm处的动力学曲线可知,中性的木素磺酸盐溶液进入ATR传感器约30s后即可达到稳定的吸收值。换言之,ATR-UV法测量亚硫酸盐废液中的木素磺酸盐需要30s,这远低于亚硫酸盐制浆或亚硫酸盐生物质预处理所需的时间,因此,ATR可以看作是一个具有实时测量功能的传感器。2.3预处理废液中反应物质的吸光系数木素磺酸盐、糠醛和HMF的校准曲线如图3所示。对三种物质而言,其光谱强度与浓度均呈线性关系,其关系式可表示如下:A=ε·c,(5)其中,ε为糠醛和HMF的摩尔吸光系数或木素磺酸盐的质量吸光系数。木素磺酸盐、糠醛和HMF在不同波长处的吸光系数如表1所示。木素磺酸盐对短波长(200～250nm)的紫外光响应值高,本文选用215nm可以避免HSO3-、SO32-等无机盐离子干扰。此外,在典型的桉木酸性亚硫酸盐预处理废液中,糠醛类物质的总摩尔浓度一般小于0.10mol/L,木素磺酸盐的质量浓度约30g/L。因此,糠醛类物质引起的误差小于6.0%。(a)木素磺酸盐1.对于糠醛和HMF,摩尔吸光系数ε的单位是mol·L-1;对于木素磺酸盐,ε的单位是mL·g-1。2.4糠醛类物质b糠醛和HMF在220nm和286nm处的吸光系数非常相近,可近似当成同一种物质。利用这两个等吸收点建立双波长校准法可同时测量木素磺酸盐与糠醛类物质的总量,如式(6)所示。[A220A286]=[ε220,Lε286,L]⋅cL+[ε220,F′ε′286,F′]⋅cF′,(6)其中,ε220,F′和ε286,F′为总糠醛类物质在220nm和286nm处的吸光系数,分别为2.317mol/L和0.310mol/L。双波长校准法无法分别计算出糠醛和HMF的浓度,但可以消除糠醛对测量木素磺酸盐的干扰。在桉木亚硫酸盐预处理废液中,HMF相对于糠醛的浓度低于15%,双波长校准法可满足较低精确度的检测要求。2.5实验方法的建立张翠等使用272、276、325nm三波长UV光谱法同时测定糠醛和HMF的浓度。考虑到酸性亚硫酸盐预处理废液中木素磺酸盐在ATR-UV光谱中,280nm处有较强吸收,而且求解三阶矩阵较为复杂,因此我们采用255、270和286nm处的光谱强度来建立一种简化的三波长校准方法。[A255A270A286]=[ε255,Lε270,Lε286,L]⋅cL+[ε255,Fε270,Fε286,F]⋅cF+[ε255,Ηε270,Ηε286,Η]⋅cΗ。(7)如表1所示,木素磺酸盐在这三个波长处的吸光系数ε很接近,可视为一个相同的值ε′。则可得:[A286-A255A286-A270]=[ε286,F-ε255,Fε286,F-ε270,F]⋅cF+[ε286,Η-ε255,Ηε286,Η-ε270,Η]⋅cΗ。(8)式(8)可分别得到糠醛和HMF的浓度。误差的主要来源是木素磺酸盐在255、270和286nm处吸光值的不同。由于木素磺酸盐对250～300nm的紫外光不敏感,因此由木素磺酸盐引起的误差很小。2.6亚硫酸盐废液检测:单波长法与三波长校准法采用三种校准方法检测亚硫酸盐废液中已知浓度的木素磺酸盐、糠醛和HMF,所得结果示于图4和图5。图4显示,单波长和双波长校准法都可得到准确的木素磺酸盐的浓度。单波长校准法的线性相关性更接近1。由于校正了糠醛等物质的干扰,双波长法测量的数据略低,但误差较小。三组平行数据的标准偏差小于±2.5%。应用于酸性亚硫酸盐废液时,单波长校准法得到的数据与双波长校准法得到的数据一致。这表明,在亚硫酸盐生物质预处理过程中,HSO3-和SO32-离子和糠醛类物质对于木素磺酸盐的检测无明显影响。糠醛和HMF的浓度可由双波长和三波长校准法得到。两种方法测量值与高效液相色谱法(HPLC)测定的数据具有较高的线性相关性。考虑到亚硫酸盐制浆和酸性亚硫酸盐预处理过程中都以保留纤维素为目的,糠醛类物质生成的总量能反映半纤维素糖类的降解程度。值得一提的是,不同的生物质得到的木素磺酸盐其ATR-UV光谱特性可能不同,因此,在后续的工作中仍需要分析木素磺酸盐的种类对ATR-UV光谱测试方法的影响。2.7温度对亚硫酸盐脱木素的影响在亚硫酸盐预处理过程中,木素的降解在升温阶段即已发生(图6a)。在三种温度条件下,升温阶段与保温阶段脱除木素的量相当。升温至180℃的过程中,降解溶出的木素量可达到25%,相当于在170℃反应20min的结果。亚硫酸盐脱木素反应的程度受温度的影响十分明显。在160℃温度下保温10min后,脱木素率稳定在12%左右不再有明显增加;在180℃温度下保温20min左右,木素脱除率即达到一个临界值(34%)。因此,从脱木素程度来看,亚硫酸盐预处理的保温时间不需要超过20min。图6b中显示了预处理保温阶段糠醛和HMF随时间的增长。在160℃和170℃条件下,保温15min以内糠醛总量的增加不明显。但温度为180℃时,升温阶段产生的糠醛总量已达到0.05mol/L,相当于3%左右的单糖发生了降解。保温30min后,大约6%的碳水化合物单糖降解成为糠醛或HMF。