第四节 人类基因组计划

第三节人类基因组计划一、人类基因组计划介绍二、序列图以前计划三、测序与序列图四、后基因组安徽大学生命科学学院查向东根据原书及其它资料制作一、人类基因组计划介绍人类基因组计划的产生与“肿瘤计划”的搁浅是分不开的。美国从70年代起启动了“肿瘤计划”，结果令人失望。人们渐渐认识到，包括癌症等人类疾病与基因直接或间接相关,测出基因序列，则是研究基因的基础。这时，科学家们面临两种选择：要么“零敲碎打”地从人类基因组中分离和研究出几个肿瘤基因，要么对人类基因组进行全测序。1986年3月，杜伯克在美国《科学》杂志上发表了《癌症研究的转折点：测序人类基因组》的文章，后来被称为人类基因组计划的“标书”。杜伯克说，正确的选择是对人类基因组(30亿个碱基对)进行全测序。

人类基因组计划进程

1984年12月，美国犹他大学的魏特受美国能源部的委托，主持讨论了DNA重组技术及测定人类整个基因组DNA序列的意义。1985年6月，美国能源部提出“人类基因组计划”的初步草案。1986年6月，在新墨西哥州讨论了人类基因组计划的可行性，随后美国能源部宣布这个草案。在纽约冷泉港讨论会上，诺贝尔奖金获得者吉尔伯特以及伯格主持了“人类基因组计划”的专家会议。1987年初，美国能源部与国家医学研究院为人类基因组计划下拨了启动经费550万美元。1987年总额年1．66亿美元。美国开始筹建“人类基因组计划”实验室。1989年，美国成立“国家人类基因组研究中心’，诺贝尔奖金得主、DNA分子双螺旋结构模型的提出者詹姆斯·沃森担任第一任主任。1990年，美国国会批准美国的“人类基因组计划”在10月1日正式启动。其总体规划是准备在15年内至少投入30亿美元，进行对人类的基因组分析。

世界其他国家也开始了基因测序工作中国的人类基因组计划于1993年开始，成为国家自然科学基金委员会、国家高技术计划、和国家重点基础研究计划共同资助的“重大项目”。由著名遗传学家组成了这个项目的顾问委员会，由中青年科学家组成学术专家委员会；还有一个“中国人基因多样性委员会”和“社会、法律、伦理委员会”，另有一个秘书处负责国际联络、国内协调与日常事务。二、序列图以前计划

30亿个碱基对是一个很长的序列，搞清这个长序列需要其他辅助工作配合。“人类基因组计划”分为两个阶段：DNA序列图以前计划和DNA序列图计划。

序列图以前计划包括物理图、遗传图。（一）、遗传图不同基因或序列在染色体上的分布与排列，称连锁图。作图方法:

1.二点或三点测验

2.系谱分析

3.细胞融合与辐射

4.DNA标记作遗传图

物理图有两个要素：一是序列，二是位置。物理图就像路标。（二）、物理图所谓“物理图”是以特定的DNA序列为标记，利用酶切位点或分子杂交的方法确定这些特定的DNA标记在基因组或DNA上的相对位置的排列图，以DNA的实际长度(Mb、Kb或bp)为它们之间的图距。

1.限制酶切位点作图

限制酶切位点作图是以DNA分子上特定位置的限制性酶切位点的相对位置作图。2.荧光原位分子杂交(FISH技术)

荧光原位分子杂交是将分子标记(也叫探针)和完整的染色体上的DNA分子互补杂交来确定标记的位置。进行原位杂交时，先将染色体贴在载玻片上，加温使双链DNA螺旋变性成为单链分子,随后加入荧光探针并降温，使DNA复性，带荧光的探针和染色体上的DNA同源部分互补杂交，用荧光显微镜观察信号，定位序列的位置。早年的FISH技术仅用于细胞分裂中期的染色体的定位，由于染色体是高度浓缩的，两个荧光标记至少距离在1Mb以上才能被分开，因此用此法不足以构建有效的物理图。近年来，一系列使DNA伸展和梳理的技术使FISH分辨率大大提高，达到可用于染色体物理作图的目的。3.序列标签位点（SequenceTagSite，STS）标记是根据单拷贝的DNA片段两端的序列，设计一对特异引物，扩增基因组DNA而产生的一段长度为几百bp的特异序列。STS标记采用常规PCR所用的引物长度，因此PCR分析结果稳定可靠。RFLP标记经两端测序，可转化为STS标记。实际上，任何一个惟一的DNA序列均可作为STS.一个DNA序列要成为STS，须满足两个前提。首先它的序列必须是己知的，以便于用PCR方法检测STS在不同DNA片段中存在与否。第二个要求是STS必须在待研究的染色体上有唯一的定位.

4.表达序列标记表达序列标记简称EST，是通过cDNA克隆分析而得到的短序列.EST可以是一个完整基因的一个片段。只有当EST在基因组中是单一序列而不是一个家族成员的DNA时．它才可以作为一种STS。

1996年10月，Homosapiens的一个全基因组转录图发表于Science上（Schuleretal.,1996）。这个图由～15000个不同的表达序列组成，由放射性杂交法定位。1998年确定了人类基因组20104个EST，并将其定位于16354个不同位点上，平均作图密度达到每183kb一个标记，占到总物理图标记的1/3，大大提高了物理图的分辨率。利用EST作为标记所构建的分子遗传图谱被称为转录图谱。（三）、克隆文库由于基因组太大，为了减少文库的克隆救量，科学家通常先构建大片段DNA克隆和连续克隆系，如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)和噬菌体人工染色体(PAC)等，在这些大片段克隆的基础上再构建亚克隆系，为测序提供大小合适的片段。以大肠杆菌进行DNA克隆实验为例:第一步，DNA用限制酶消化或超声波等方法处理；第二步，用限制酶消化克隆体．该酶在环状载体上只Y有一个酶切位点；第三步，连接产生重组DNA分子。个别染色体的分离

有时为了方便或工作上的分工，一批科学家可以先集中做一条染色体工作，建立覆盖一条染色体的特异克隆文库。这需要利用流式细胞仪，这种仪器可以帮助分离单个染色体。操作时先小心地从含有凝缩染色体的细胞中获得一套完整的染色体，然后用荧光染料对染色体染色，因为结合染料的分量依赖于染色体的长度，较大的染色体结合的染料较多，因此荧光强度比短染色体强。加上稀释液后，染色体通过小孔以形成液滴流，每一个液滴只含一根染色体，当液滴通过监测仪器时，就可以根据荧光强度判断所含的染色体，再经过电脑操作，在含所需要染色体的液滴上加上电荷，当它通过电场时将它与其他液滴分开。如果两个不同的染色体长短相近，如人类的第2l号和22号染色体，大小非常接近，这时可根据它们所含的碱基AT和GC的丰富程度不同来加以区分。对应AT和GC丰富区的高亲和染料分别是Hoechst33258和染色素A3,因此可根据它们结合特异性染料的量的多少将它们区别开来。

三、测序与序列图（一）、测序方法因为—个反应只能测得几百个核苷酸序列，对于高等生物基因组来说，这不过是几十万分之一的序列长度。在此基础上，科学家又作了—个重要的改进，用一组毛细管电泳来替代聚丙烯酰胺凝胶电泳，在以上荧光自动化检测过程中．我们已经看到4种带荧光的ddN可以合并在一条泳道中进行。那么，把泳道细化成毛细管，一组毛细管电泳仪有96道，一次可同时完成96个片段的测序，一天就能测1000个左右的片段。（二）、DNA序列的连续组装

我们的目的是要完成由几千万到几亿核苷酸组成的一条染色体全序列，甚至是全基因组序列，这就要求解决如何将这些短序列拼接起来这一问题。目前，常有三种方法用于基因组的研究。这些是：鸟枪法、克隆叠连群法与指定鸟枪法。目前主要应用的是后两种。

流感嗜血杆菌DNA用超声波打断，长1.6～2.0kb的片段从琼脂糖凝胶纯化，连入质粒载体建成克隆文库。文库中的克隆测序后得到末端序列，用计算机找出序列间的重叠区。共得到140个序列重叠群，由此拼按出完整的基因组序列。2001年2月，国际人类基因组测序联合体和美国Celera公司联合公布了人类基因组序列工作草图和初步分析结果。

人类基因组序列图是向全世界开放的，是全人类的一份财富，所有感兴趣的个人和团体都可以通过其网站(/genome/seg/)获取你所要知道的信息，深入研究基因组科学。除了人类基因组外，其他物种的基因计算也先后启动。已完成大约800种生物的全基因组测序。如大肠杆菌、酵母、线虫、拟南芥（5条染色体近120Mb的测序，发现该基因组编码25000个以上基因）。2000年美国两家农业生物技术公司宣布了水稻(粳稻日本晴)基因组框架图，中国科学院及北京华大基因组2001年10月完成了粳稻93•11基因组框架图，发现水稻可能编码5万多个基因。２００３年，我国科学家在国际上率先独立完成钩端螺旋体、表皮葡萄球菌、野油菜黄单胞菌三种重要人类和植物病原体的全基因组精细测序，同时还在国际上首次识别出了与它们生命活动密切相关的整套基因，并发现了一批与致病性相关的功能基因，鉴定出了一批可望用于发展新一代疫苗的靶标基因。微生物基因组学在谈到微生物基因组学研究未来的发展方向时，赵国屏表示，后基因组时代的一项重要工作便是功能基因组学研究，它是利用结构基因组提供的海量生物学信息，通过发展和应用新的实验手段，在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白质研究转向对多个基因或蛋白质同时进行系统的研究，是在碱基序列-基因组静态-完成后转入对生物学功能-基因组动态-的研究。测序是重要的，不应该不重视测序，但同时又不能只看重测序，关键是在做完微生物测序以后，如何利用测序所得到的结果和数据进行功能研究，找到有意义的科学发现，并使之投入到实际应用中去，这需要科学家静下心来，踏踏实实地搞好研究工作。四、后基因组时代ThePost-GenomicEraFunctionalgenomics，又称为后基因组Postgenomics研究基因组中各基因的功能，包括基因的表达及其调控模式的学科。利用结构基因组学研究所得的各种信息在基因组水平上研究编码序列及非编码序列生物学功能的学科。（一）、搜寻DNA序列中的基因

获得DNA序列后，无论是一些DNA片段或是整个染色体，都可以通过多种途径从中找出和定位基因，也可以由计算机根据序列的特征对DNA进行筛查。1、寻找阅读框

2、筛查同源性序列

由于多年的积累，许多不同物种的基因已经被成功克隆和测序，利用这些已知的序列，可以对基因组或一段DNA进行同源性检索，区分它是基因还是随机序列，弥补高等真核生物基因组中阅读框搜寻的不足。同源序列的筛查还有利于发现代表生物进化上的相关基因，并且研究基因的功能。（1）Norther杂交法既然表达序列一定会转录成RNA，那就可以用分子杂交办法来测定。RNA分子用凝胶电泳分离，用Northern印迹法将RNA转到膜上，然后用标记的DNA片段进行Northern印迹，出现条带的，就可以证明此片段表达RNA。基因的表达，因细胞种类、发育时期的不同而异，所以某种细胞是否转录某种RNA，以及含量多少是有明显区别的，分析时必须考虑到这些情况。3.确认基因搜寻到基因之后，一般还需要确认基因。具体方法是两种分子杂交法。

（2）动物园杂交法鉴于细胞是否转录某种RNA受组织特异性表达和发育时间的影响，因此有人发明用其他生物中相关的DNA序列替代本生物体RNA来进行分子杂交。相关生物种的同源基因有相似的编码序列，而非编码序列则差别较大。将一个物种的DNA片段用于相关物种DNA的分子杂交检测，且有一个或多个杂交信号，用此探针就可能确认一个或多个基因，这种方法被称为动物园杂交法(Zooblotting)。种属间印迹的目的是判断人DNA片段能否与相关种属的DNA杂交。制备人、黑猩猩、牛和兔的DNA，用限制酶酶切，然后进行琼脂糖电泳，最后以人DNA片段为探针进行Southern杂交。每个动物DNA中都可见一阳性信息，说明此人DNA片段含有一表达的基因。注意牛和兔的杂交片段要比人和黑猩猩的小。这表明在牛和兔中表达顺序周围的限制图谱是不同的，但这并不影响得出四个种属中存在同源基因的结论。（二）基因功能的研究

这是基因研究中既重要又艰巨的工作之一。由于许多物种的基因组测序工作已经完成，找到可能是基因的序列比以前上百年来依靠突变分析要快得多。例如大肠杆菌编码蛋白的基因，现认为是4288个，而以往几十年通过突变鉴定仅测得1853个，只占总数的43%，新发现的基因占57％，这些新发现的基因就需要先作功能预测，再进一步确定其功能。而酵母还有70％的基因的功能需要预测和确定。这两个被人们研究得比较透彻的模式生物，还有那么多的基因等待研究，其他生物，特别是高等生物有待研究的基因的比例就更大了。

1．计算机同源比较预测功能

同源比较不仅是计算机发现新基因的重要手段，也是预测基因功能的重要依据。同源基因来自于共同祖先，基因序列相似，根据出现种属分化的前后又可以分为正同源(种间同源)和副同源(种内同源)两种，前者同源基因存在于不同物种中，说明它们的共同祖先出现于种属分化之前；而后者是指同一物种生物内部的同源基因，常是多基因家族的成员，它们的共同祖先可能是早于，也可能是晚于种属分化。通常，一对同源基因并不完全相同，只能说是很相似，因为在长期进化过程中，它们各自随机突变积累了差异。如果新测序的基因和另一个原来已测序的基因序列相似，那么新基因有可能和原来基因有相同或相似的功能。2．实验分析法确定基因的功能经典遗传学的思路从表型入手，通过突变体来确定相关基因，而基因组测序和基因搜寻之后，是采用一个相反的策略，