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文档简介

第十章原核生物基因表达的调控生物的遗传信息是以基因的形式储藏在细胞内的DNA(或RNA)分子中的。随着个体的发育,DNA有序地将遗传信息,通过转录和翻译的过程转变成蛋白质,执行各种生理生化功能,完成生命的全过程。从DNA到蛋白质的过程,叫做基因表达(geneexpression),对这个过程的调节就称为基因表达调控(generegulation或genecontrol)。基因调控是现阶段分子生物学研究的中心课题。要了解生物生长发育的规律、形态结构特征和生物学功能,就必须弄清楚基因表达调控的时间和空间概念。基因表达调控在两个水平上体现(1)转录水平上的调控(transcriptionalregulation);(2)转录后水平上的调控(post-transcriptionalregulation),包括①mRNA加工成熟水平上的调控(differentialprocessingofRNAtranscript);②翻译水平上的调控(differentialtranslationofmRNA)。无论原核还是真核生物,其基因调控主要发生在转录水平上,包括在转录的起始阶段和终止阶段。对于原核生物,以营养状况(nutritionalstatus)和环境因素(environmentalfactor)为主要的基因表达影响因素。在真核生物尤其是高等真核生物中,激素水平(hormonelevel)和发育阶段(developmentalstage)是基因表达调控的最主要手段,而营养和环境因素的影响力大为下降。在转录水平上对基因表达调控取决于DNA的结构、RNA聚合酶的功能、蛋白因子及其他小分子配基的相互作用。基本概念操纵子(operon)很多功能上相关的结构基因在染色体上串连排列,由一个共同的控制区来操纵这些基因的转录。包含这些结构基因和控制区的整个核苷酸序列就称为操纵子(operon)。一个完整的操纵子主要包括启动子、操纵基因、结构基因和终止子。2.阻遏物和激活物(reperssorandactivator)结构基因:编码蛋白质或RNA的基因。调节基因:参与其它基因表达调控的RNA和蛋白质的编码基因。其编码的调节蛋白称为阻遏物或激活物。调节蛋白具有与其它DNA结合蛋白类似的结构特征:螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix,HTH)。两个螺旋分别由7-9个氨基酸残基构成,其间间隔4个氨基酸残基。两个螺旋之间约为直角,螺旋2嵌入DNA双螺旋大沟内,负责与DNA的特异性结合,称为“识别螺旋”;螺旋1中的氨基酸与DNA的磷酸戊糖骨架非特异性结合,基本上平行于双螺旋。CⅠ蛋白的N端含有5个螺旋,第2和第3个螺旋形成HTH(螺旋-转角-螺旋)3.负调控和正调控(negativeandpositiveregulation)调节蛋白与DNA特定位点的相互作用,启动或增强操纵子的转录活性,这种调控方式叫做正调控,如激活物参与的调控。调节蛋白与DNA特定位点的相互作用,关闭或降低操纵子的转录活性,这种调控方式叫做负调控,如阻遏物参与的调控。4.诱导物和共阻遏物(inducerandcorepressor)效应物(effector):能与调节蛋白结合并改变其性质的小分子化合物。诱导物:与调节蛋白结合后启动操纵子转录的效应物。共阻遏物:与调节蛋白结合后关闭操纵子转录的效应物。第一节转录水平的调控一、转录的起始

转录是原核生物基因表达的主要调控点,主要涉及两个方面:1、RNA合成的酶系;2、RNA合成起始和终止信号,即DNA分子上的特定序列。通过RNA聚合酶、转录因子和启动子的相互作用实现转录调控,改变细胞的表型,从而实现细胞生理状态和环境的变化。1.RNA聚合酶(RNApolymerase):

大肠杆菌的RNA聚合酶:由5个亚基组成,即α2ββ’σ,有时还有2个ω亚基。以α2ββ’σ组成的酶称全酶。σ亚基与其他亚基结合较松弛,易从全酶上解离;其余部分α2ββ’称为核心酶(coreenzyme)。在大肠杆菌中还发现一种新的σ因子,称为σ’因子,因此将含有σ亚基的全酶称为全酶I,含有σ’亚基的称为全酶Ⅱ。二者的不同在于:全酶Ⅱ可以利用双链DNA为模板合成po1y〔A)。σ亚基作用:参与启动子的识别和结合以及转录起始复合物的异构化。细胞内哪条DNA链被转录、转录方向与转录起点的选择都与σ亚基有关。离体实验表明:全酶所转录的RNA和细胞内所转录出的RNA,其起始点相同,序列相同,若仅用核心酶进行转录,则模扳链和起始点的选择都有很大的随意性,而且往往同一段DNA的两条链都被转录。由此可见:σ亚基对识别DNA链上的转录信号是不可缺少的,它是核心酶和启动子之间的桥梁。σ因子的取代在细胞发育和对环境应答的反应中起主导作用。2.启动子(promotor):

转录的起始是基因表达的关键阶段,启动子就是连接在基因5’端上游的DNA序列,其长度从100bp到200bp不等,是转录起始时RNA聚合酶识别、结合的特定部位,但其本身并不被转录。此外,启动子还包括与调节蛋白结合的位点。在启动子与终止子之间是一个转录单位,通常将mRNA开始的一个核苷酸定为起点(即+1).由此向右常称为下游(downstream),其核苷酸依次编为正序号;起始点左例称为上游(upstream).其核苷酸则依次以负号表示.紧接起始点左侧的核昔酸为-1。启动子区的上游激活序列和操纵基因启动子区中与正调节蛋白结合的位点,叫做上游激活序列(upstreamactivatingsequence,UAS),一般位于-35区上游;与负调节蛋白结合的位点称操纵基因(operator),一般与启动子重叠。具有UAS序列的启动子,一般没有典型的-35区,因此RNA聚合酶不能很好地与之结合。只有当激活蛋白结合在UAS上后,通过与RNA聚合酶在空间上相互作用或改变启动子区中与RNA聚合酶结合部位的DNA的构型,从而提高启动子的活性。如大肠杆菌中依赖cAMP-CAP激活的乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等操纵子。有时,一个基因或操纵子需要2个相互分开的操纵基因,一个位于转录起点附近,另一个在距离启动子区约几百bp的上游或下游。其中每个操纵基因都与一个阻遏物结合,然后两个阻遏物在空间上相互作用,形成一个DNA环,从而抑制RNA聚合酶与启动子的结合。二、σ因子与转录起始调控---

σ因子的替代可以控制起始1.在E.coli,不同类型的启动子需要不同类型的σ因子在正常的温度和环境下,大肠杆菌主要依靠σ70进行基因的转录。当环境温度升高时,许多原核和真核生物都会产生热激状态,正常表达的基因会关闭或表达水平下降,而编码热激蛋白(heatshockprotein)的基因开始表达,这些蛋白质能提高菌体对高温的抵抗力,此即谓热激反应。在大肠杆菌中,编码热激蛋白的基因有30多种,其中绝大多数热激基因的启动子是σ32。2.枯草芽孢杆菌中σ亚基的更替与生活周期的转变目前已从枯草芽孢杆菌中发现至少10种σ因子,其中正常生活的RNA聚合酶的σ因子为σ43,识别与σ70相同的启动子保守序列。大部分σ因子转换的例子都发生在孢子形成(sporulation)中。孢子形成分为三个阶段(1)DNA复制;(2)在细胞的一端基因组被分离;(3)分离的基因组外包上一层子外壳。细菌孢子的形成和释放

F对E的活性控制在前孢子中由早期基因产生

G,G使RNA聚合酶在前孢子中转录晚期孢子形成基因。另一个早期孢子形成基因产物负责和母细胞中的成分联系,

F激活SpoⅡR,SpoⅡR由前孢子分泌,然后它激活膜结合蛋白SpoⅡGA。活化的SpoⅡGA在母细胞中剪切失活的前体物Pro-E使其成为活化因子E。三、转录的终止和抗终止1.终止子的结构

DNA上提供转录停止信号的一段序列称为终止子(terminator),是一个基因的末端或是一个操纵子的末端的一段特定序列。与启动子不同,终止子能被转录成mRNA。类型:强终止子和弱终止子强终止子:不依赖于Rho蛋白质辅助因子而能实现终止作用,这类终止子属于强终止子;弱终止子:依赖于Rho因子才能实现终止作用,这类终止子属于弱终止子。蛋白质辅助因子称为释放因子,通常称为ρ因子。所有原核生物的终止子共同的序列特征:即在转录终止点之前有一段回文结构,因而所产生的mRNA可形成茎环状的发夹结构,它可使RNA聚合酶的移动停止或减缓。强终止子回文结构中富含GC对,在回文序列的下游常有6—8个A,因此这段终止子转录后形成的RNA具有与A相对应的寡聚U,是使RNA聚合酶脱离模板的信号。依赖于ρ因子的终止子其回文序列中GC对含量较少,回文序列下方没有固定结构,其AU对含量也较低;由于其茎环结构常较短,在没有ρ因子时这种茎环结构不稳定。如果没有ρ因子存在,RNA聚合酶会继续转录下去,产生通读(readthrough),当ρ因子存在时,转录才能终止。在强终止子中,转录的RNA在终止子部位形成的发夹结构破坏了转录泡中RNA-DNA杂合链的形成,而RNA-DNA杂合链能帮助RNA聚合酶固定在DNA链上,因此转录泡中的RNA-RNA发夹结构使RNA聚合酶变得不稳定,结果RNA聚合酶和RNA都从DNA链上脱离,转录终止。ρ因子辅助的终止作用ρ因子结合于正在合成的RNA的rut(rhoutilizationsite)位点(如果rut位点被核糖体翻译,则ρ因子不能与之结合),利用其依赖于RNA的ATP酶活性水解ATP获得能量沿RNA按5’-3’方向移动;当RNA聚合酶遇到终止子而暂停转录时,ρ因子得以在终止子处追上RNA聚合酶并进入转录泡的RNA-DNA杂合链中;其RNA-DNA解旋酶活性使杂合双链解旋,释放RNA聚合酶,转录终止。2.基因表达的极性效应在正常情况下原核基因表达时,其转录出来的mRNA随即进行翻译,这时整个mRNA都覆盖着核糖体,ρ因子无法接近mRNA,而RNA聚合酶早已越过前面的基因的依赖ρ因子的终止子,所以转录实际上并不停止,而是继续转录后续基因。如果在某一基因的依赖于ρ的终止子之前发生无义突变,核糖体便从无义密码子上解离下来,翻译停止,于是ρ就可以自由进入RNA并移动,直到赶上停留在终止子上的RNA聚合酶,结果使RNA聚合酶释放,不能再转录下游基因。基因表达的极性现象:在某些情况下同一转录单元里,由于一个基因的无义突变,阻碍了下游相邻基因表达的效应,就称为基因表达的极性现象。除了无义突变可以导致极性现象外,插入序列IS1、IS2等DNA片段插入到操纵子的基因中也会发生极性现象。3.抗终止作用(anti-termination)ρ因子的作用可以被抗终止因子所抵消,这样,RNA聚合酶便可通过终止子(依赖于ρ因子的)继续转录后面的基因,这种现象称为抗终止作用(anti-termination)。第二节操纵子类型可诱导负控制系统可诱导正控制系统可阻遏负控制系统可阻遏正控制系统操纵子调控系统的基本类型原核生物结构基因表达的4种调控类型一、大肠杆菌乳糖操纵子1)大肠杆菌的乳糖利用系统大肠杆菌的乳糖代谢需要有β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的催化,这种酶能把乳糖水解为半乳糖和葡萄糖,或转化为异乳糖作为诱导物。另外有β-半乳糖苷透性酶和β-半乳糖苷转乙酰酶,前者协助乳糖分子穿膜进入细胞内,后者可将乙酰基从乙酰辅酶A上转移至β-半乳糖苷上。三种酶协同作用,使得乳糖得以分解和利用。乳糖操纵子的负调控β-半乳糖苷酶催化乳糖的两种反应诱导物

的加入

和去除

对lacmRNA及LacZ合成

的影响项目功能结构基因3个不同结构基因能够产生3种不同的酶。(lacZ、Y、A)操纵基因(O)是结构基因的开关.通过对RNA聚合酶阻抑与否来控制结构基因的转录或停止。启动子(P)是RNA聚合酶与DNA结合的部位,可识别转录起始点。调节基因(I)有自己独立的转录单位,能产生阻遏蛋白,通过与操纵基因的结合与否来控制操纵基因的关闭和开启。乳糖操纵子的结构和功能2)乳糖操纵子的负调控(可诱导)诱导因子:异乳糖、ß-半乳糖苷、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPDG)。机制:没有诱导物时,具有活性的阻遏物和操纵基因结合,转录不能进行。有诱导物时,乳糖与阻遏物结合,使阻遏物发生构象变化而失活,不能与操纵子结合,结构基因正常转录,进而再翻译出蛋白质。IPTG:有极强的诱导效应,本身又不被分解,称为非底物诱导诱导物和阻遏

蛋白结合的模型3)乳糖代谢的突变型1961年Jacob&Monod等通过对突变体的研究,证明了调节基因和操纵基因的存在。通过构建部分二倍体,如:F’lacI-lacZ+Y-A+XF-lacI+lacZ-Y+A-lacI-lacZ+Y-A+/lacI+lacZ-Y+A-,发现了以下突变:lacI

S

阻遏蛋白不可诱导性突变,阻遏蛋白失去诱导物结合位点,始终作用于结构基因,为超阻遏突变型。lacI

-

阻遏蛋白不能形成寡聚物,对lacI+隐性。lacI

-d

阻遏蛋白不能和DNA结合,且呈负互补(反式显性)Oc

操纵基因的组成型突变,只对同一染色体上的结构基因起作用,为顺式显性。关于lacI-d阻遏蛋白上具有两种不同类型的结合位点:DNA-结合位点识别操纵基因,诱导物结合位点与小分子诱导物结合。一旦与诱导物作用使其构象发生改变而失去与操纵基因DNA结合的能力。DNA-结合位点的突变是组成型的(因为阻遏物不能和DNA结合来阻断转录)。诱导物结合位点的突变是不可诱导性的(由于诱导物不能减少阻遏物和DNA的亲和力)。阻遏物功能的一个重要的特点是形成多聚体蛋白。在细胞中阻遏蛋白的亚基随机结合成四聚体。当不同的lacI

等位基因存在时,它们的产物作为亚基结合成异聚四聚体,其特性和同聚四聚体不同。这种亚基之间的作用类型具有多聚体蛋白的性质,被称为等位基因间的互补(interalleliccomplementation)。阻遏蛋白的结构:N端:1~59aa,头部片段,为HTH,与操纵基因DNA大沟结合;核心区:有6个折叠,诱导物就结合在两个核心区之间的裂缝中;C端:为两组亮氨酸拉链,形成四聚体。阻遏蛋白单体

的三级结构负的互补(negativecomplementation):此lacI-d的突变导致阻遏蛋白不能和操纵基因结合。因此它像lacI

-等位基因一样,使操纵子呈组成型表达。由于lacI-类型的突变产生的阻遏物没有活性,它相对于野生型基因是隐性的,而“-d”这个符号表示负互补这种突变类型是显性的。这种突变称反式显性(trans-dominant),也称为显性失活(dominantnegatives)。这种显性的原因是由于lacI-d等位基因产生一个“坏”的亚基,减少了与DNA结合位点的数目,使四聚体和操纵基因的亲和力减少。不仅它本身不能结合操纵基因的DNA,而且它还通过作为四聚体的一部分阻止四聚体中“好”的亚基与DNA结合。这就意味着阻遏蛋白四聚体是作为一个总体,而不是单个单体的简单的集合,这对完成阻遏来说是很必要的。在体外将“好”的亚基和“坏”的亚基混合起来也会产生破坏作用。2.乳糖操纵子的正调控1)cAMP-CAP的正调控作用cAMP由腺苷环化酶(adenylatecyclase)催化合成。CAP(cataboliteactivatorprotein,分解代谢物激活蛋白)22.5kD,是原核生物基因表达的一种正调节蛋白。乳糖启动子的-70到-50区是cAMP-CAP的结合位点。cAMP-CAP以两种方法来激活转录:(1)它可能直接和RNAPol相互作用;(2)作用于DNA,改变其结构,从而帮助RNAPol结合。cAMP-CAP可结合于相对于启动子的不同位点2)分解代谢产物阻遏作用当培养基中有葡萄糖存在时,即使有乳糖存在,也不诱导靶基因表达。这种现象称为葡萄糖效应或分解代谢产物阻遏,这样的操纵子称葡萄糖敏感操纵子。葡萄糖抑制操纵子的原理:cAMP-CAP复合物的形成取决于AMP的浓度,当以葡萄糖为能源时,由于其抑制腺苷酸环化酶的活性,ATP不能转化为cAMP,cAMP浓度下降,不能形成cAMP-CAP复合物,RNA聚合酶无法结合在DNA上,结构基因不表达。3)代谢物阻遏与诱导的关系受CAP调控的操纵子,其转录必须满足2个条件:培养基中缺少葡萄糖;有操纵子的诱导物存在。乳糖操纵子:两个开关第一:cAMP-CAP复合物——受葡萄糖影响第二:异乳糖复合物——受乳糖影响二、半乳糖操纵子(galactoseoperon)大肠杆菌半乳糖操纵子包括3个结构基因:

异构酶(UDP-galactose-epimerase,galE)

半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galactosetransferase,galT)

半乳糖激酶(galactosekinase,galK)这3个酶的作用是使半乳糖变成葡萄糖-1-磷酸。因为半乳糖的利用效率比葡萄糖低,人们猜想葡萄糖存在时半乳糖操纵子不被诱导,但实际上有葡萄糖存在时,gal操纵子仍可被诱导。现已分离到一些突变株,其中一类突变株能在不含葡萄糖的培养基中高水平合成半乳糖代谢酶类(gal结构基因高效表达);而另一类突变株中gal基因的表达完全依赖于葡萄糖,培养基中如无葡萄糖存在,这些细菌的gal基因不表达,不合成半乳糖代谢酶类。分析gal操纵子P-O区的DNA序列发现,该操纵子确实存在两个相距仅5bp的启动子,可以分别起始mRNA的合成。每个启动子拥有各自的RNA聚合酶结合位点S1和S2。从S1起始的转录只有在培养基中无葡萄糖时,才能顺利进行,RNA聚合酶与S1的结合需要半乳糖、CAP和较高浓度的cAMP。从S2起始的转录则完全依赖于葡萄糖,高水平的cAMP-CAP能抑制由这个启动子起始的转录。当有cAMP-CAP时,转录从S1开始,当无cAMP-CAP时,转录从S2开始。结构特点

(1)双启动子:P1依赖于cAMP-CAP,转录起点为+1,-10顺序位于-12~-6,称为-10S1;P2不依赖于cAMP-CAP,转录起点为-5,-10顺序位于-17~-11,称为-10S2;

(2)双操纵基因:OE位于CAP位点内,OI在galE内部;

(3)无-35顺序。

Gal既可为碳源,同时UDP-Gal又是合成细菌细胞壁的重要前体。gal操纵子的结构(1)有GalP1启动K,T,E转录无Glc无GalP1不启动无GalOE与OI

结合形成环,仅转有录20bp有GalP2启动S2

转录galE,组成型(2)CAP-cAMP对P1正调节,对P2

抑制(3)阻遏物对P1,P2

都是负调控,CAP-cAMP含量少时P2可转录(机制不清)(4)P1与RNAPol亲和力>>P2与RNAPol亲和力,所以在没有Glc而有Gal存在时,P1转录,而P2不转录。2.调节没有葡萄糖的条件下有Gal存在时,galR(位于62ˊ)编码的阻遏物失活,CAP结合在-47~23区域,RNAPol结合在-10S1区,CAP和RNAPol直接相互作用,使P1顺利转录;无Gal时,GalR结合在OE上,OE离启动子有一段距离,当GalR结合在OE上时不大可能像lac操纵子中lacI阻遏那样去阻碍RNAPol的结合,它阻断S1的转录可能有两种方式:影响cAMP-CAP和RNA聚合酶的作用;或通过干扰cAMP-CAP与DNA的相互作用来阻断。有葡萄糖存在的情况下,cAMP-CAP含量少当Gal存在时,P1不能启动而P2启动,RNA聚合酶结合在-10S2顺序上,-10S2(TATGCTA)和-10S1(TATGGTT)顺序相似,从S2开始转录galE而不转录另外的2个基因galT和galK。若无Gal存在,GalR可结合在OE和OI上,并使DNA弯曲形成茎环结构。S2位点阻遏作用和S1的阻遏机制完全不同,在上述条件下,即使有GalR存在,P2仍不受阻遏开始转录(组成型),但由于OI上也有GalR的结合并且成环,故转录只进行20bp便停止,这个过程如何发生尚不清楚。为什么gal操纵子需要两个转录起始位点?半乳糖不仅可以作为唯一碳源供细胞生长,而且与之相关的物质--尿苷二磷酸半乳糖(UDPgal)是大肠杆菌细胞壁合成的前体。在没有外源半乳糖的情况下,UDP-gal是通过半乳糖差向异构酶的作用由UDP-葡萄糖合成的,该酶是galE基因的产物。生长过程中的所有时间里细胞必须能够合成差向异构酶。假如只有S1一个启动子,那么由于这个启动子的活性依赖于cAMP-CAP,当培养基中有葡萄糖存在时就不能合成异构酶。假如唯一的启动子是S2,那么,即使在葡萄糖存在的情况下,半乳糖也将使操纵子处于充分诱导状态,这无疑是一种浪费。无论从必要性或经济性考虑,都需要一个不依赖于cAMP-CAP的启动子(S2)对高水平合成进行调节。三、阿拉伯糖操纵子参与阿拉伯糖代谢的酶基因分为3个操纵子,即araBAD、araE和araF,它们位于染色体的不同位置,但都由一个共同的调节基因araC进行调控。这种由一个调节基因同时控制几个操纵子的系统,称为调节子(regulon)。1.结构:具有正负调节功能的操纵子。2.特点:(1)araC和araBAD有各自的启动子PC、PBAD,它们的转录方向相反。(2)AraC有双重功能,既可起正调控作用,又可起负调控作用;(3)O:O1,位于-140~-110之间,阻遏蛋白AraC结合后对araBAD只表现轻微的阻遏作用

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