第22章 分子生物学常用技术

第二十一章常用分子生物学技术的原理及应用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication第一节

分子杂交与印迹技术

MolecularHybridization&BlottingTechnology核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)

。一、分子杂交与印迹技术的原理（一）印迹技术（二）探针技术

探针(probe)一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。

二、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹技术

(Southernblotting)

用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。（二）RNA印迹技术

(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析

(Westernblotting)

用于蛋白质定性定量及相互作用研究。

PaperTowelsSouthernBlottissueSDSProtKPhenolChloroformethanolprecipitationSpinSouthernanalysisRNA印渍技术主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。NorthernBlot放射自显影照片目录WesternblotWesternBlot三种印迹技术的比较

其他斑点印迹(dotblotting)原位杂交(insituhybridization)DNA点阵(DNAarray)DNA芯片技术(DNAchip)原位杂交原位杂交技术可分析基因在染色体上的位置原位杂交（insituhybridization,ISH）是利用分子杂交技术对基因在染色体上定位的一种技术。基本程序是细胞或组织固定→预杂交→杂交→冲洗→放射自显影或标记酶显色→分析结果。原位杂交的特点是杂交在显微镜载玻片上中期染色体标本上进行。荧光原位杂交（FISH）是一种非放射性原位杂交方法，用特殊荧光素标记核酸（DNA）探针；已有多重原位杂交，分辨率可达100～200kb.原位杂交时使用荧光探针发现染色体上的一个基因③分子杂交实验①②目录限制性内切酶谱分析法

限制性内切酶

特异性DNA探针

待测序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶酶切位点发生改变，导致酶谱的改变（如特异性片段的大小和多少改变），使得电泳迁移率改变×MstⅡ酶切位点(GCTNAGG)5´3´正常基因5´3´突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析RLFP分析法中性突变：人基因组中，平均每200对碱基可发生一次突变，这种突变对生物体的生存既没有好处，也没有害处。DNA多态性：中性突变导致个体间核苷酸序列的差异。限制性片段长度多态性:由于多态性发生限制性酶切位点上，导致导致酶切可产生长度不同的片段。第二节

聚合酶链反应

PolymeraseChainReaction1983.4KaryMullis在开车前去北加利福尼亚红树县Redwoodcountry的一条被月光笼罩的山路上构思了PCR随后卖给了Roche公司价格：10.000$

1993Nobelprize

模板DNA

特异性引物耐热DNA聚合酶

dNTPsMg2+

二、PCR体系基本组成成分三、PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列测定（五）参与基因突变分析的检测四、PCR的主要用途PCR诱变在引物中引入非配对碱基，通过PCR引物可以在扩增产物中引入点突变，目的基因1目的基因2内参actin1234采用PCR技术也可以分析基因拷贝数三、几种重要的PCR衍生技术（一）反转录PCR技术（二）原位PCR技术（三）实时PCR技术RT-PCR分析基因转录水平的变化

逆转录PCR（reversetranscriptionPCR，RT－PCR）又称RNA－PCR。

逆转录PCRReversetranscriptase-PCRAAA(A)n5‘-CapmRNA(dT)12~18

primeranneal5‘-CapAAA(A)n3‘5‘ReversetranscriptasedNTP5‘-CapAAA(A)n5‘cDNA:mRNAhybridRegu