奶牛亚临床酮病诊断指标的选择

奶牛亚临床酮病诊断指标的选择

奶牛生产疾病是奶牛无法满足高产代谢需求而导致的疾病的总称。奶牛生产疾病以往主要是指低钙血症、酮病、脂肪肝和低镁血症等主要的代谢病,现已将瘤胃酸中毒、真胃变位、胎盘停滞和蹄叶炎等疾病也纳入生产疾病范畴。过渡期(围产期)是奶牛生产疾病的高发期。因此,生产疾病对奶牛的健康、生产性能和经济效益至关重要。就目前而言,即便在饲养管理规范的奶牛场,奶牛生产疾病的发病率较比几十年前并没有大的减少,甚至呈现只增不减的趋势。目前,奶牛生产疾病大多以亚临床的形式发生,如亚临床酮病、亚临床低钙血症的发病率往往是临床型病例的几倍甚至十几倍,过渡期奶牛亚急性瘤胃酸中毒的发病率也很高。患亚临床生产疾病的病牛大都不表现明显的临床症状,使得该类疾病的临床诊断很困难。因此,建立亚临床生产疾病早期诊断方法和技术,开展奶牛群体营养代谢状监测,预测预报牛群生产疾病的发生,是防治奶牛生产疾病的有效技术手段。1奶牛疾病的早期诊断选择奶牛生产疾病早期诊断指标的基本原则是灵敏、特异、简便、实用、价廉。1.1亚临床酮病的诊断价值传统的奶牛酮病诊断主要依赖临床症状和尿、乳酮体的检测。尿、乳酮体检查主要是检测乙酰乙酸,因其化学性质不稳定易于氧化,且含量不如β-羟丁酸(β-hydroxybutyricacid,BHBA)高,以致尿液酮体检查的结果敏感性高但特异性差,存在假阳性;而乳汁酮体检查特异性高但敏感性低,存在假阴性。为弥补尿、乳酮体检查的不足和缺陷,国外研发了检测乳汁BHBA的试纸条,在一定程度上提高了酮病诊断的准确性。2008年我们实验室研制出检测乳汁BHBA的奶牛亚临床酮病诊断试纸条,特异性、敏感性、重复性和稳定性符合国家标准,达到了国外同类产品的水平,但其价格仅为国外同类产品的1/3,已获国家发明专利授权。与尿、乳酮体检查相比,测定血清BHBA诊断酮病的准确性和敏感性更高。近年来,国外兽医临床提出酮病诊断的‘金标准’:BHBA>1.2mmol/L,葡萄糖(Glucose)<2.5mmol/L。临床酮病血清BHBA>1.5mmol/L,亚临床酮病血清BHBA=1.2~1.4mmol/L。Iwersen等评价了手持电子BHBA测定仪诊断酮病的价值。全血BHBA浓度为1.2、1.4mmol/L时,其检测的敏感性分别为88%和96%,特异性分别为96%和97%,优于2种常用的化学试纸条(KetostixandKetolac),但其检测尿液和乳汁的阳性和阴性预测值很低。认为应用电子BHBA测定仪检测全血BHBA可用于亚临床酮病的诊断。由于采血检测BHBA在生产实际受到一定限制,寻找新的诊断标志物和建立更便于牛旁检测(cowsidetest)特别是群体诊断的方法和技术是亚临床酮病早期诊断的关键。VanderDrift等采用傅里叶变换红外光谱(fouriertransforminfrared(FTIR)spectroscopy)检测乳汁酮体和BHBA浓度,结果表明仅凭乳中酮体和BHBA的浓度诊断酮病价值有限,因有较大比例的假阳性。在整个泌乳期间,乳汁高丙三醇磷酸胆碱(glycerolphosphocholine,GPC)值与低酮病发病率关联。泌乳1个月时,GPC/PC摩尔比等于或大于2.5指示发生酮病的危险性很低。乳汁GPC和PC(phosphocholine)的浓度可反映降解磷酸胆碱作为脂肪酸来源以满足泌乳早期能量需求增加的能力。也有人提出乳汁柠檬酸盐可能是能量负平衡的生物标志物,但其临床诊断价值还有待进一步确定。迄今为止,尚未有比检测血清BHBA诊断亚临床酮病准确性更高的方法和技术。1.2肝脏超声活性肝组织活检技术是目前奶牛脂肪肝诊断唯一可靠的方法。根据肝组织甘油三酯(TG)的含量(%湿重)可判断脂肪肝的轻重:TG含量1%~5%为轻度,5%~10%为中度,>10%为重度。由于肝组织活检属介入性诊断技术很难为奶牛场的管理者所接受,在很大程度上限制了其应用。寻找适合兽医临床需要的非介入性诊断方法和技术已成为奶牛脂肪肝研究的热点。可用于脂肪肝检验诊断的血液生化指标主要包括以下几类:(1)能量代谢指标,如NEFA、BHBA、葡萄糖等;(2)蛋白代谢指标,如白蛋白、总蛋白、尿素氮(BUN)、VLDL等;(3)肝机能指标,如GGT、AST、SDH等肝特异性酶,胆红素、胆酸等胆汁流动指标。Kalaitzakis等认为血清鸟氨酸氨基转移酶(ornithinecarbamoyltransferase,OCT)和谷氨酸脱氢酶活性,及NEFA/胆固醇比值是脂肪肝良好的指征。血清apoB-100,apoA-ⅠandapoC-Ⅲ浓度降低,卵磷脂胆固醇酰基转移酶(lecithin:cholesterolacyltransferase,LCAT)活性降低,及触珠蛋白和血清淀粉样蛋白A浓度增加与脂肪肝和脂肪肝相关疾病的发生密切相关。因此,测定载脂蛋白和酶活性有助于这些疾病的早期诊断。测定血清胆汁酸对脂肪肝的诊断价值不大,因其浓度的变动大。可作为人脂肪肝的标志物有:细胞角蛋白-18片段(CK-18),脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(AFABP)和成纤维细胞生长因子(FGF21)等。值得指出,这些指标并不是脂肪肝的特异性诊断指标,且在轻、中度脂肪肝病牛未必呈现明显变化,其诊断的敏感性和特异性未必能满足奶牛脂肪肝早期诊断的需要。肝脏超声作为一种非介入性诊断技术有可能成为奶牛脂肪肝诊断的手段和方法。Starke等应用经皮和术中肝表面直接多普勒超声检测覆盖在门脉上面的肝脏大小和厚度。记录评价了脂肪肝患牛肝门血流(PBF)速度和静脉搏动指数(VPI)。经皮超声的影像不清,术中肝表面直接超声结果表明,脂肪肝病牛VIP和PBF速度降低,且与肝脂沉积程度负相关,可能是脂肪浸润降低了肝脏血管的柔韧性,在TG含量>150mg/gFW时,其改变尤为明显。Starke等检验了肝脏超声影像刻度式数字分析诊断奶牛脂肪肝的准确性。数字分析采用计算机辅助超声诊断新方法(CAUS)。151头受试牛肝脂质量浓度在4.6~292.4mg/g(FW)。肝TG含量与平均回波水平(r=0.59)和残留衰减(r=0.80)高度相关,残留衰减和平均回波水平高度相关(r=0.76)。根据回归方程建立的接器工作特征曲线下面积是0.94(<50与≥50mgTAG/g湿重),0.83(<100与≥100mg),0.97(<50与≥100mg)。认为数字分析肝脏超声影像的CAUS方法和软件作为一种牛群脂肪肝非介入性筛选方法是可行的。采用单参数线性回归方程更适合实际使用。Haudum等报道,肝甘油三酯含量大致为100mg/g湿重时,超声可见肝变大,边缘变圆;超过150mg/g,肝明显增大、变厚,肝角增加。但是超声测量肝大小和形状对识别脂肪肝的价值有限,因个体间变异大。可见,超声技术用于奶牛脂肪肝的诊断还需时日,其主要瓶颈是探测途径和评价方法。1.3牛群中sara的变化SARA的诊断很困难,一方面是由于发生酸中毒后病牛临床表现不明显;二是SARA病牛瘤胃pH值每天只有数小时≤5.8,要建立诊断需连续监测瘤胃pH值,而多次经胃导管或瘤胃穿刺采集瘤胃液不切合生产实际。目前,诊断SARA的唯一方法是根据牛群常规的监测和相关疾病发病率的记录,及异常的临床常用参数(para-clinicalparameters)。瘤胃炎、采食量减少、蹄叶炎、真胃变位和真胃溃疡、瘤胃臌气及繁殖障碍等疾病的发病率增加应考虑牛群存在SARA。监视SARA的症状,如粪便发亮淡黄色,有甜酸味(sweet-sour),有泡沫,含多量未消化纤维和谷物,以及鼻出血,淘汰和死亡率显著增加。监测临床常用参数(para-clinicalparameters),如瘤胃液参数,pH≤5.8,可诊断为SARA。SARA病牛常呈现低产奶量、低乳蛋白、低乳脂。SARA继发瘤胃炎引起的急性期蛋白反应,如血清淀粉样蛋白A(amyloid-A)和血液触珠蛋白(haptoglobin)浓度增加,可能作为监测指标。近年在连续监测瘤胃pH值的方法和技术方面有了突破性进展。AlZahal等应用瘤胃无线电遥测球(radiotelemetricruminalbolus)观测了瘤胃温度与pH值的相关性,瘤胃pH最低值与其相对应的瘤胃温度呈负相关。瘤胃温度有可能预测瘤胃pH值,而有助于亚急性瘤胃酸中毒的诊断。Sato等研制出无线传输pH测定系统(radiotransmissionpHmeasurementsystem),由无线pH传感器、数据测量接收器、继电器和配有特殊软件的个人电脑。经瘤胃瘘管将pH传感器置于瘤胃实时监测瘤胃pH值的变动。Sato等通过比较瘤胃和网胃pH值变化,认为网胃pH值可用于牛SARA的诊断。1.4apoc-和酸性磷酸酶正常牛血钙维持在2.1~2.5mmol/L(8.5~10mg/dl)之间。产后12~24h血钙浓度最低。围产期奶牛血钙浓度在2.0~1.38mmol/L(8.0~5.5mg/dl)即可诊断为亚临床低钙血症。目前,除血钙尚无其他可用于亚临床低钙血症诊断的指标。Katoh等提出apoC-ⅢandapoB-100可能与乳热的发生有关,测定围产期奶牛血清apoC-Ⅲ浓度有助于乳热的诊断。脂肪肝、酮病、皱胃左方变位、乳热和胎衣不下病牛血清apoC-Ⅲ降低。apoC-Ⅲ降低与产后疾病,尤其乳热密切相关。血清酸性磷酸酶是监测饲喂阴离子盐奶牛钙代谢激活最好的生物标志物。血清脱氧吡啶啉(deoxypyridinoline,DPD)和吡啶啉(pyridinoline,PYD)是监视奶牛骨吸收有用的手段。但上述指标在奶牛亚临床低钙血症诊断的实际价值还有待验证。在寻找奶牛低钙血症早期诊断指标时,可考虑借鉴医学临床研究有关评价骨代谢的相关指标,如Ⅰ型胶原交联羧基末端肽(cross-linkedcarboxy-terminaltelopeptideoftypeⅠcollagen,ICTP)、硬化蛋白(sclerostin)、耐酒石酸盐碱性磷酸酶(tartrate-resistantacidphosphatase,TRAP)等骨更新(boneturnover)指标;骨碱性磷酸酶、Ⅰ型前胶原羧基末端前肽(carboxy-terminalpropeptideoftypeⅠpro-collagen,PICP)、骨钙素(osteocalcin)、骨保护素(OPG)等骨形成指标。2营养代谢障碍病:建立一个份营养代谢状态监测是根据预防医学的观点,通过定期监测血液、尿液、乳汁中的某些成份,评价畜群或个体营养状态,预测预报营养代谢障碍病的一种方法,又称凯谱顿代谢特征或轮廓。开展营养代谢状态群体监测,不仅可判断饲料的营养搭配是否合理,还可预测营养代谢障碍疾病的发生,是规模化奶牛场预防奶牛生产疾病的主要措施之一。2.1集体营养代谢监测指标2.1.1分离和复配以受能量后的体况分数为标准,见表1能量平衡是影响奶牛健康、泌乳和繁殖性能最为关键的因素。评价奶牛能量平衡的指标主要有:体质量、体况分数、背部脂肪的厚度、血浆β羟丁酸(BHBA)、非酯化脂肪酸(NEFA)和葡萄糖浓度。体况分数在生产实践最常应用,但其敏感性不够。血浆葡萄糖是能量平衡灵敏的指标,其浓度可能受到应激和胰岛素抵抗等因素的影响。BHBA是最常用的指标,但其不够敏感,而且可来自食物。近年来对NEFA作为判定能量平衡指标的认可度大有提升。许多研究表明,能量平衡和血清NEFA浓度密切相关。血清NEFA浓度是应答能量负平衡所致的脂肪动员的结果。因此,NEFA浓度直接反映脂肪组织分解量。过渡期奶牛,血清NEFA浓度对能量平衡改变的评价比体况分数敏感。2.1.2影响肌肉蛋白动员的因素目前尚无能直接反映蛋白质状态的单一代谢产物。所以,需要应用联合参数,如血液尿素氮(BUN)、肌酐、总蛋白、白蛋白和肌酸激酶(CK)等。BUN浓度受多种因素的影响,如日粮蛋白摄入和瘤胃可降解性、日粮氨基酸组成、相对于需要量的蛋白摄入,肝和肾机能,肌肉组织的分解,以及日粮碳水化合物的量和降解性。肌酐常被用于估计肾机能。总蛋白和白蛋白反映蛋白质的可利用性,在蛋白质缺乏时其值降低,但其改变需要一定的时间。Houweling等通过分析血浆3-甲基组氨酸(3-methylhistidine,3-MH)浓度和超声测定背最长肌厚度评价肌肉蛋白动员。血浆3-甲基组氨酸和背最长肌厚度指示蛋白动员平均启动在产前,持续到产后4周。2.1.3内环境测定与血钙浓度的关系奶牛养殖生产关注最多的宏量元素是Ca、P、K、Mg、Cl、S等,因为这些矿物元素与乳热、母牛倒地不起和弱母牛综合征等疾病的发生有关。但是,血液中多数矿物元素的浓度受到内环境恒定调控机制严格的调控。内环境恒定机能正常时,血液中宏量元素的浓度不能反映日粮状态。血液P、K、Mg、S浓度对日粮摄入的影响略微敏感。血液Na和Cl浓度在肾和消化机能紊乱以及日粮极度缺乏时可发生改变。产犊前后血钙浓度对钙调控系统的机能状态和产犊后超过2周的临床或亚临床低钙血症可能是有用的指标。由于完整的钙调控系统,血钙浓度不是很灵敏的指标。为此,测定直接与内环境恒定调控系统机能和反应相关的参数有可能提供有关矿物元素营养状态的信息,例如尿Ca、P和羟脯氨酸等的排泄。上述监测奶牛能量、蛋白质和矿物质营养代谢状态的主要目的是评价日粮搭配是否合理,而目前奶牛养殖生产则侧重过渡期奶牛生产疾病的监测。2.2.1产前血清及其产物的临床表现近年来国外学者采用监测过渡期奶牛血液代谢物预测预报生产疾病的发生。常用的血液、乳汁代谢物主要是反映能力代谢状态的指标,如NEFA和BHBA等。一般认为产前2周血清NEFA浓度和产后2周内血清BHBA浓度与生产疾病的发生、产奶量、繁殖性能和淘汰率的关联度较大。预计分娩前最后7~10d高NEFA浓度(>0.4mmol/L)与真胃变位和胎盘停滞的发病率、泌乳60d内淘汰率的增加及泌乳头4个月的产奶量减少有关。产后第1或第2周亚临床酮病(血清BHBA>1.2~1.4mmol/L)与提高真胃变位、子宫炎、临床酮病、子宫内膜炎、延迟产后不排卵的发病率、增加乳房炎严重性和泌乳初期低产奶量有关。Chapinal等的试验表明,产前1周升高的血清NEFA浓度与增加产后胎盘停滞、子宫炎和真胃变位的风险度有关。产犊前后2周的NEFA和钙浓度与真胃变位的风险度相关。真胃变位和酮病高发牛群呈现低代谢指数(therevisedquantitativeinsulinsensitivitycheckindex,RQUICKI),糖、胰岛素和非酯化脂肪酸增加。产后头3周,RQUICKI作为真胃变位和临床酮病高发牛群的指征比单个参数敏感,但其应用价值尚需证实。Geishauser等认为产后第1、2周血清AST和BHBA可用于后来发生的皱胃左方变位的诊断试验。血清AST活性和BHBA浓度越高,其后诊断皱胃左方变位的几率越高。产后第2周的血糖和钙浓度越低,其后诊断皱胃左方变位的几率越高。人工饲喂试验诱发的皱胃左方变位病牛在临床诊断之前主要表现为干物质摄入减少(<6.5kg/d)和产奶量减少(<8kg/d)。在临床诊断前10d内,血液钙、葡萄糖、胰岛素浓度显著减低,而NEFA、β羟丁酸浓度和AST活性显著增加。血清NEFA和BHBA浓度的临界阈值是根据其产前产后浓度的变化与之后生产疾病发生的相关性确定的。Ospina等设定的预测真胃变位、临床酮病、胎盘停滞和子宫炎等疾病血清NEFA临界阈值为产前0.29mEq/L,产后的为0.57mEq/L;血清BHBA的临界阈值为产后10mg/dL。血清NE-FA作为生产疾病预报指标的危险比率>1.8,BH-BA的危险比率>2.3。虽然产前血清NEFA和产后BHBA与临床疾病发生显著相关,但产后血清NEFA浓度与产奶30d内真胃变位、酮病、子宫炎和胎盘停滞发生的危险关系最大。Duffield等报道,产犊后第1周血清BHBA浓度≥1.2mmol/L与后来真胃变位发生的优势比(oddsratio)为2.60与子宫炎的优势比为3.35;判断真胃变位风险度产后2周BHBA临界阈值为≥1.8mmol/L,其优势比为6.22。根据产后第1、2周血清BHBA预测后来临床酮病发生的最佳阈值分别是1.4mmol/L,优势比为4.25、5.98。产后第1、2周期间最大的BHBA与低产奶量、低乳脂率和低乳蛋白率相关。影响产奶量的产后第1、2周血清BHBA浓度分别为≥1.2mmol/L和≥1.4mmol/L。对产奶量影响最大的产后第1、2周血清BHBA浓度分别为1.4mmol/L(-1.88kg/d)和2.0mmol/L(-3.3kg/d)。血清BHBA浓度1.4mmol/L确定为高酮血症,其增加了产后2周患病的风险度,可引起泌乳初期产奶量的明显减少。总之,对表现亚急性瘤胃酸中毒相关临床症状(跛行、瘦弱、群淘汰率和死亡率高)的牛群应测定瘤胃液pH,监测亚急性瘤胃酸中毒的发生情况。通过检测泌乳早期血液BHBA浓度监测牛群亚临床酮病的患病率,尤其适用于泌乳初期真胃变位发病率高或淘汰率高的牛群。对泌乳3周有亚临床酮病的牛群,应考虑检测临近分娩牛的血清NEFA浓度,以确定临近分娩牛的能量负平衡。检测产犊当天奶牛的血钙浓度有助于及早发现亚临床低钙血症,监测日粮所引发的钙内稳方面的问题。2.2.2日粮dcad与乳热饲养管理水平直接影响奶牛的生产性能和健康状态。生产疾病的发生与饲养管理密切相关。所以,奶牛生产疾病的监测离不开对饲养管理的评价。诸多饲养管理因素可影响生产疾病的发生。在生产实际中常纳入监测范围的危险因素涵盖:牛的特征、营养、环境和管理因素。牛群特征包括品种、胎次、年龄、体况、产奶量等。营养危险因素主要是日粮组成及营养水平。环境、管理因素包括季节、气候、舍饲、放牧、运动、干乳期长度及产前挤奶等因素。研究发现,日粮钠和钾含量高,氯和硫含量低,低钙血症发病率增加,而日粮钠和钾含量低,氯和硫含量高或添加阴离子盐,低钙血症发病率降低。因此,根据强离子差(SID)理论建立了阴阳离子差(DCAD)方程,即DCAD(meq/100gDM)=(Na++K+)-(Cl-+S2-)。计算日粮DCAD可预测牛群乳热的发生。在此基础上,国外学者运用荟萃分析(meta-analysis)预测乳热的发生。根据产犊前日粮营养成分(%DW),按(Na++K+)-(Cl--S2-)计算DCAD(meq/100gDM),和暴露产前日粮的天数,可按下列任何一个方程计算:乳热的发生与DCAD的线性相关,指示DACD降低预示乳热发生减少。方程中加上暴露产前日粮天数是因为暴露产前日粮从产前20d增加到30d可使乳热发病增加42%。2.3样品采集2.3.1亚临床酮病感染监测以往的做法是:一般在泌乳初期(泌乳10~20d)、泌乳中期(泌乳50~60d)和干乳期(产犊前7~10d)采样。每年至少采样3次,即春、秋、冬季各1次。如前所述,鉴于生产疾病主要发生在过渡期(产前3~4周至产后3~4周),近年来把过渡期作为监测的重点,特别是产前1~2周至产后1~2周。亚临床酮病患病率在泌乳头6周最高,峰值在泌乳第2周。测定泌乳早期血液BHBA监测牛群亚临床酮病的患病率可应用于所有的牛群,尤其泌乳初期高真胃变位发病率和淘汰率的牛群。监视产犊当天牛的低钙血症可提供有关日粮所引发的钙内稳方面的问题早期监测。Kida通过对泌乳期和干乳期围产期疾病高发牛群和无围产期疾病牛群代谢谱试验,采用每10d标准(theten-daycriteria)在高围产期疾病牛群能检出体况过度,低白蛋白、胆固醇和镁,及高NEFA血症的牛。所以,每10d标准能发现群和个体的代谢异常,可成功用于围产期奶牛。由此可见,监测牛群产前、产后1~2周营养代谢状态有助于生产疾病的早期诊断和预测预报。2.3.3群体代谢产物的检测即便是按每群牛3个泌乳阶段最低样品数量21头份计算,其检测费用也很高。为此,提出混合样品的做法,即将每一泌乳阶段7头牛的样品制备成1个检测样品,其结果代表了某一个泌乳阶段奶牛群体的变动趋势。与个体平均值相比,对大多数代谢产物来说,混合样具有相同的价值。混合样品NEFA和BHBA浓度与个体样品平均值和NEFA和BHBA浓度超过预定阈值牛的数量呈显著相关。混合样品NEFA和BHBA浓度对群体亚临床酮病的检测相当准确,每群10头牛的样本大小是适当的。2.3.4牛群的选择和处理受试牛不是随机选择的,应选择同一泌乳阶段具有代表性的体况一般的牛,不可选择体况过高或过低的牛。对于更换饲料的牛群,应在2周后待瘤胃活性完全恢复后进行。摄食影响血液生化指标的改变,特别是喂饲过多精料的牛,应在挤奶后2h采样。自由采食的可任意选择采样时间。2.4产奶量和血清brba的监测指标是一个群体阈值(threshod)又称临界点(criticalpoint)或截点(cutpoint)。监测指标阈值是根据发病前监测指标的变动与后来生产疾病