第七章 酶工程

学习目的

初步掌握酶的发酵生产和分离纯化的大致流程以及酶制剂的保存法。对酶的固定化、酶的修饰改造和主要的酶反应器类型有一定的认识。了解生物传感器及酶对现代人类生活的影响。第七章酶工程

1、酶工程的发展趋势

随着生物技术的发展，酶工程将引起发酵工业和化学合成工业的巨大变革。21世纪酶工程的热点和前题，可能包括基因工程和蛋白质工程的应用，人工合成酶和模拟酶、核酸酶和抗体酶，分子酶学，酶的定向固定术，杂交酶，分子发动机，酶化学技术，非水酶学，糖生物学和糖基转移酶，酶标药物，端粒酶，极端环境微生物和不可培养微生物的新酶种，酶在环境保护方面的应用等。

一、引言细胞融合

动植物细胞细胞融合物理化学诱度野生菌株采集基因工程细胞微生物培养基空气

发酵罐能量发酵液预处理

废料酶分离纯化酶制剂菌体酶提取分离

固定化酶酶的化学修饰可溶性酶吸附色埋交联化学连

逆胶束酶酶电极

酶热敏电阻酶反应器产品回收工艺

废料

轻工食品工业医药分析生物工程产品

2、酶工程研究内容

二、酶的发酵生产

1、酶的来源从动植物组织中分离提取植物细胞培养产酶

动物细胞培养产酶

微生物发酵产酶

2、微生物作为酶生产来源的优点生长繁殖快，生活周期短，产量高，酶比活很高；

培养方法简单，原料来源丰富，经济效益高；微生物菌株种类繁多，酶的品种齐全；可以通过诱导、诱变及基因工程等方法培育出新的产酶量高的菌种。3、优良产酶菌种的筛选

（1）优良的产酶菌种应具备的优点繁殖快、产酶量高能在便宜的底物上生长良好产酶性能稳定、菌株不易退化产生的酶容易分离纯化（2）产酶菌种的筛选方法筛选步骤产酶菌株的检测胞外酶的产酶菌株的检测胞内酶的产酶菌株的检测4、基因工程菌（细胞）的构建

构建基因工程菌的目标改善原有酶的各种性能扩充可安全使用的酶源

酶基因克隆及表达的基本步骤

能产生目的酶的生物

酶的纯化总mRNA的纯化

测定N端部分氨基酸序列mRNA

设计引物RT-PCR

与合适的载体重组、重组子筛选与鉴定

转入工业生产用的宿主（工程菌或工程细胞），如米曲霉

酶的工业化生产

克隆酶基因的宿主-载体系统应具备的特性所希望的酶占细胞总蛋白量的比例要高;菌体容易大规模培养，生长无特殊要求；载体与宿主相容，且能在宿主中稳定维持；宿主的蛋白酶尽可能少；宿主菌对人安全，不分泌毒素。

5、微生物酶的发酵生产（1）培养基

碳源氮源无机盐类生长因子

pH值

（2）酶的发酵生产方式

固体发酵法

液体深层发酵法

温度

通气和搅拌

pH值

固体发酵车间（3）提高酶产量的措施添加诱导物

酶的作用底物

酶的反应产物

酶的底物类似物

降低阻遏物浓度

表面活性剂

添加产酶促进剂

6、酶的分离纯化

提取和分离纯化酶时一般应注意的条件

温度

pH值

盐浓度

搅拌微生物污染

HPLC

（1）酶制剂的制备破碎细胞溶剂抽提离心分离浓缩干燥高速冷冻离心机（2）酶的纯化与精制

根据酶分子大小和形状的分离方法离心分离

差速离心速率区带离心等密度梯度离心

超速冷冻离心机凝胶过滤原理介质的特性

类型工作范围（相对分子质量）床体积/（ml/g干胶）葡聚糖凝胶

SephadexG-10<2002～3G-15<1502.5～3.5G-251000～6000

4～6G-501500～30000

9～11G-7530000～70000

12～15G-1004000～150000

15～30G-1505000～400000

20～30G-2005000～800000

30～40

葡聚糖/双丙烯胺凝胶

SephacrylS-200

5000～250000S-30010000～1500000S-40020000～8000000透析与超滤

透析在纯化过程中极为常用，通过透析可以除去酶液中的盐类、有机溶剂、低分子质量的抑制剂等。超滤是指在一定压力（正压/负压）下，将料液强制通过一定孔径的滤膜以达到分离纯化的目的，也可用于酶液的浓缩及脱色等。根据酶分子电荷性质的分离方法离子交换层析

-O-CH2CH2N（C2H5)2+OH--O-CH2CH2N(C2H5)2OH

-O-CH2CH2N（C2H5）2+E-COO--O-CH2CH2N(C2H5)2+OH-

OHE-COO

-O-CH2CH2N(C2H5)2+Cl--O-CH2CH2N(C2H5)2+E-COO-

E-COOCl

离子交换原理示意图原理蛋白质纯化过程常用的几种离子交换剂

名称种类解离基团交换当量阴离子交换剂DEAE-纤维素弱碱性二乙氨基乙基0.1～1.1氨乙基纤维素弱碱性氨乙基－DEAE-纤维素碱性稍强三乙氨基0.5～1.0DEAE-Sephacel二乙氨基乙基1.3～1.5DEAE-Sephadex弱碱性二乙氨基乙基3.0～4.0QAE-Sephadex二乙氨基乙基2.6～3.4-2-羧丙基阳离子交换剂CM-纤维素弱酸性羧甲基－CM-Sephadex弱酸性羧甲基4～4.5

介质特性层析聚焦层析聚焦类似于等电聚焦电泳，但其连续的pH梯度是在固相离子交换载体上形成的。它既具有等电聚焦电泳的高分辨率，又具有柱内容量大的特点，具有较大的应用价值。

电泳由于不同蛋白质所带净电荷的大小和性质不同，在外电场作用下，其泳动方向和速率也不同，从而达到分离的目的。等电聚焦电泳它属于移动界线电泳法。电泳仪根据酶分子专一性结合的分离方法亲和层析利用酶分子的专一性结合位点或特异的结构性质来达到分离的目的；它具有结合效率高、分离速度快的特点。染料配体亲和层析利用染料与酶或酶的辅基特异结合的特点，达到对酶的分离。由于染料分子与被纯化的酶没有任何生物学关系，因此严格地说只能被称之为假亲和层析。

共价层析利用层析介质与被分离的酶之间形成共价键而达到分离的目的。层析分离5.2.2.4根据分配系数的分离方法

双水相萃取分离某些聚合物与一些无机盐或另一种聚合物相混合，当浓度达到一定范围时，体系会自动分为两相，由于生物活性物质在两相中具有不同的分配比，经过反复处理则可达到分离的目的，这种分离方法称为双水相萃取分离。

聚合物P、Q和水系统的相图示意图

几种常用的两水相系统聚丙二醇-聚乙二醇聚丙二醇-聚乙烯醇非离子型聚合物-聚丙二醇-葡聚糖非离子型聚合物聚乙二醇-聚乙烯醇聚乙二醇-葡聚糖聚乙二醇-聚乙烯吡咯烷酮带电荷聚电解质-DEAE-葡聚糖-HCl-聚丙二醇NaCl非离子型聚合物-聚乙二醇Li2SO4两种聚电解质羧甲基葡聚糖钠盐-羧甲基纤维素钠盐聚乙二醇-磷酸钾聚合物-无机盐聚乙二醇-硫酸铵聚乙二醇-硫酸钠5.2.3酶的纯度与酶活力

酶的纯度

酶的活力酶的比活力5.2.4酶制剂的保存

温度缓冲液

氧化/还原

蛋白质的浓度及纯度

超低温冰箱5.3酶分子的改造5.3.1酶分子修饰酶分子化学修饰酶分子化学修饰的目的

制备修饰酶的目的

提高酶活力改进酶的稳定性允许酶在一个变化的环境中起作用改变最适pH值或最适温度改变酶的特异性使它能催化不同的底物改变催化反应类型提高催化过程的反应效率（引自Smith，1996）酶分子化学修饰应注意的事项

修饰剂的要求酶性质的了解反应条件的选择酶修饰剂的类型

修饰酶的特性

天然酶和修饰酶的特性比较——耐温特性比较

酶修饰剂处理条件残留酶活/％天然酶修饰酶ß-葡萄糖苷酶右旋糖酐60℃/40min4182尿酸酶人血清白蛋白37℃/48h5095尿激酶聚丙烯酰胺17℃/2d50100-丙烯酸糜蛋白酶肝素37℃/6h080（24h）糜蛋白酶聚（-乙烯75℃/117h61100吡咯烷酮)天然酶和修饰酶的特性比较——最适pH比较

酶修饰剂天然酶修饰酶

尿酸酶（猪肝）白蛋白10.57.4~8.5尿激酶（猪肝）聚乙二醇8.29.0

天然酶和修饰酶的特性比较——其他特性比较

酶修饰剂特性天然酶修饰酶胰蛋白酶右旋糖酐抗失活因子抗自身水解抗大豆蛋白酶抑制剂抗尿素胰蛋白酶聚乙二醇抗失活因子抗大豆蛋白酶抑制剂 抗原性抗原性消除尿酸酶白蛋白抗失活因子抗胰酶 抗原性抗原性消除体内半衰期4h20h尿激酶白蛋白抗失活因子抗胃蛋白酶抗胎盘抑制剂 体内半衰期

20min90min

酶蛋白质工程的程序图三维结构新蛋白质设计蓝图蛋白质利用基因产物分子模型X射线晶体衍射基因诱变克隆和表达开发5.3.2酶的蛋白质工程酶蛋白质工程的策略分子裁减

定点突变

对随机诱变的基因库进行定向的筛选和选择

杂交酶（hybridenzyme）

——利用高度同源的酶之间的杂交

——创造具有新活性的杂交酶

5.3.3生物酶的人工模拟

生物酶的人工模拟模拟酶抗体酶（abzyme）印迹酶——分子印迹酶——生物印迹酶

分子印迹聚合物的制备流程图5.4生物催化剂的固定化

酶固定化的目的

固定化

共固定化

联合固定化

酶与微生物细胞联合固定化体系的应用联合固定化生物催化剂微生物酶应用领域参考文献黑曲霉过氧化氢酶生产葡萄糖酸姜明等生物化学与生酵母纤维二糖酶生产乙醇物物理进展，1991，酵母胃蛋白酶葡萄汁发酵18（1）：26 酿酒酵母果胶酶葡萄汁发酵面包酵母β-葡萄糖苷酶生产乙醇隋德新，生物科学动态，酿酒酵母β-半乳糖苷酶生产乙醇1988，（3）：19酵母糖化酶啤酒酿造酿酒酵母木糖异构酶木糖发酵大肠杆菌葡萄糖氧化酶牛奶防腐

淀粉水解酶淀粉泡盛曲霉葡萄糖

02 菌体运动发酵单孢菌 菌体 乙醇

泡盛曲霉（Asp.awamori）和运动发酵单菌（Z.mobilis）联合固定化体系代谢模式

酶工程

5.4生物催化剂的固定化

定向固定化每一个酶蛋白分子通过其一个特定的位点以可重复的方式进行固定化；蛋白质的定向固定化技术有利于进一步研究蛋白质结构；这种固定化技术可以借助一个与酶蛋白的酶活性无关或影响很小的氨基酸来实现。

酶工程

5.4生物催化剂的固定化

5.4.1酶的固定化方法酶固定化方法分类还没有一种固定化方法可以普遍地适用于每一种酶。特定的酶要根据具体的应用目的选择特定的固定化方法。已建立的固定化方法，大致可分为三类：载体结合法、交联法和包埋法。

酶工程

5.4生物催化剂的固定化

酶固定化方法示意图（引自戚以政等,1996）（1）离子结合；（2）共价结合；（3）交联；（4）聚合物包埋；（5）疏水相互作用；（6）脂质体包埋；（7）微胶囊

酶工程

5.4.1酶的固定化方法

5.4.1.1载体结合法物理吸附法：是制备固定化酶最早采用的方法，它是以固体表面物理吸附为依据，使酶与水不溶性载体相接触而达到酶吸附的目的。

离子结合法：该法是通过离子效应，将酶分子固定到含有离子交换基团的固相载体上。

酶工程

5.4.1酶的固定化方法螯合法：这是一种比较吸引人的技术，它主要是利用螯合作用将酶直接螯合到表面含过渡金属化合物的载体上，具有较高的操作稳定性。共价结合法：共价结合法是通过酶分子上的官能团，与载体表面上的反应基团发生化学反应形成共价键的一种固定化方法，是研究得最多的固定化方法之一。

酶工程

5.4.1.1载体结合法

5.4.1.2共价交联法共价交联法是通过双功能或多功能试剂，在酶分子间或酶分子和载体间形成共价键的连接方法。

5.4.1.3包埋法将酶包埋在高聚物凝胶网格中或高分子半透膜内的固定方法。前者又称为凝胶包埋法，后者则称为微囊法。

酶工程

5.4.1酶的固定化方法5.4.2细胞的固定化方法5.4.2.1包埋法

将细胞包埋在多微孔载体内部制备固定化细胞的方法称包埋法，可分为凝胶包埋法、纤维包埋法和微胶囊包埋法。5.4.2.2吸附法

主要是利用细胞与载体之间的吸引力，使细胞固定在载体上。

酶工程

5.4生物催化剂的固定化

5.4.3固定化酶（细胞）的性质

酶活力的变化

酶稳定性提高

最适pH值的变化最适温度的变化

动力学常数的变化

酶工程

5.4生物催化剂的固定化

5.4.4固定化酶（细胞）的指标

相对酶活力

酶的活力回收率

固定化酶的半衰期

酶工程

5.4生物催化剂的固定化

5.5酶反应器

酶反应器的定义

以酶为催化剂进行反应所需要的设备称为酶反应器。

酶工程

5酶工程

酶反应器的分类

按酶的状态来分，酶反应器有两种类型：一类是直接应用游离酶进行反应的均相酶反应器；另一类是应用固定化酶进行反应的非均相酶反应器。若按其结构和功能来分，则有许多类型。