第五章 药用植物分子鉴定

第五章药用植物分子鉴定

试讲人：田恩伟科室：药植与中药鉴定教研室MolecularIdentificationofMedicinalPlants中药材市场假药多教学内容1.了解遗传标记定义、类型、优缺点，掌握分子遗传标记定义、原理和在药用植物鉴定中的应用。熟悉PCR的原理和步骤。2.掌握常用的分子标记（RFLP、RAPD、SSR、ISSR、SNP）原理和方法。3.重点掌握药用植物分子鉴定的方法和流程（以柴胡为例）。第一节遗传标记（geneticmarker）定义：由一对等位基因差异造成的，能够明确区分，遗传传递过程可以跟踪的相对性状或生物特征。如形态上的质量性状：花瓣颜色、种子颜色、叶片颜色、叶片形状、种子形状等。1.形态标记（MorphologicalMarkers）遗传学上稳定、可见的外部特征---遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果，这种标记可以用于研究物种间关系、分类和鉴定。如植株高矮、花瓣颜色、叶片颜色、叶片形状、种子形状等。优点：简单、直观缺点：仅对个体性状的描述，得出的结论不完善；另外数量性状易受环境影响。遗传标记的类型孟德尔豌豆杂交试验所研究的七对性状

都是典型的形态学遗传标记2.细胞学标记（CytologicalMarkers）染色体数目变异及结构变异，表现在染色体核型如数目、大小、着丝点位置变异等。优点：直观、快速而经济缺点：但变异十分有限，当染色体数目形态相似时难以分辨。王喻宁等，20133.生化标记（BiochemicalMarkers）生化标记：指把植物体内的某些生化性状作为遗传标记，如贮藏蛋白、同工酶等。这种标记可用于绘制“指纹图谱”进行植物系统发育、亲缘关系和种类鉴定研究。同工酶：指够催化相同的化学反应，但分子结构、理化特性等不同的一组酶。3.生化标记（BiochemicalMarkers）优点：经济、方便、成本较低缺点：结构基因表达产物，对非结构基因无能为力；所检测位点只是基因组一部分；数量有限，有时受发育时期和环境影响。4.分子标记（molecularmarkers）分子标记是指能够被检测出来的DNA序列上的遗传多态性（等位差异）。TCTTGGAGACTCACTATAGGCTACGCGTACATCAGATAG|||||||||||||||||||||||||||||||||TCTTGTAGACTCACTATAG.....GCGTACATCAGATAG品种1品种2碱基差异长度差异4.1分子标记的检测方法两个步骤：获得目标DNA片段：酶切，扩增（PCR）检测不同样品间目标片段的差异（多态性）：电泳，分子杂交，DNA芯片（高通量）TCTTGGAGACTCACTATAGGCTACGCGTACATCAGATAG|||||||||||||||||||||||||||||||||TCTTGTAGACTCACTATAG.....GCGTACATCAGATAG电泳方向品种1品种2品种1品种2长度差异片段电泳检测：4.2分子标记的特点本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点：（1）不受季节、环境、基因表达与否的限制；（2）多态性高，存在着丰富的等位变异；（3）数量丰富，多态性遍及整个基因组；（4）多数分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂合基因型，提供完整的信息。遗传学上，把共显性定义为F1代中，双亲的性状同时表现的现象。共显性能够将杂合体和纯合体从表现上区分开。共显性：F1P1F1通过比较药用植物种间DNA分子遗传多样性差异来鉴别其种类的方法。4.3分子标记的应用：药用植物分子鉴定狭叶柴胡Bupleurumscorzonerifolium北柴胡BupleurumchinenseChaoetal.2014Phytomedicine

中国柴胡有42种，17变种DNA分子标记技术直接分析生物的基因型，与上述传统的方法比较，具有下列优点：

遗传稳定性：DNA分子作为遗传信息的直接载体，不受外界因素和生物体发育阶段及器官组织差异的影响，每一个体的任一体细胞均含有相同的遗传信息。因此，用DNA分子特征作为遗传标记进行物种鉴别更为准确可靠。

遗传多样性：DNA分子是由G、A、C、T四种碱基构成，为双螺旋结构的长链状分子，生物体特定的遗传信息便包含在特定的碱基排列顺序中，不同物种遗传上的差异表现在这4种碱基排列顺序的变化，这就是生物的遗传多样性(geneticdiversity)。比较物种间DNA分子的遗传多样性的差异来鉴别物种就是DNA分子遗传标记鉴别(identificationbyDNAmoleculargeneticmarker)。

化学稳定性：DNA分子作为遗传信息的载体，除具有较高的遗传稳定性外，在诸多的生物大分子中，比蛋白质、同功酶等具有较高的化学稳定性。不象蛋白质和同功酶那样，在生物体死亡后，很快失去生物活性，并迅速降解。在陈旧标本中所保存下来的DNA仍能够用于DNA分子遗传标记的研究。4.4分子标记的类型分子标记的发展经历了三个阶段，也称为三代DNA分子标记：第一代分子标记（以分子杂交为核心）：RFLP；第二代分子标记（以PCR为核心）：RAPD；AFLP；SSR；ISSR分子标记第三代分子标记（以DNA测序为核心）：单核苷酸多态性(SNP)；表达序列标签(EST)；ITS聚合酶链式反应

PolymeraseChainReaction（PCR）PCR定义：是一种模拟体内DNA复制过程的体外酶促合成特异性核酸片段的技术。PCR原理：以待扩增的两条DNA链为模板，由一对人工合成的寡核苷酸引物(15-25碱基)介导，通过DNA聚合酶酶促反应，在体外进行特异DNA序列扩增。PCR三步骤①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右5min，使模板DNA双链解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板－引物结合物于72℃左右在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

小结与思考小结：1.四种类型遗传标记中，分子标记具有其他遗传标记无法比拟的有点，遗传稳定性、多态性、化学稳定性，在药用植物或生药鉴定中应用最为广泛的标记。2.PCR技术是分子标记的基础，PCR原理和步骤为：变性-退火-延伸。思考：1.分子标记进行药用植物鉴定依据的是什么？

2.与三种传统遗传标记相比，分子标记优势体现在哪些方面？

3.理解PCR的原理和步骤。参考书及相关文献资料参考书：1.《中药生物工程》,主编:高文远,上海科学技术出版社.2《中药现代生物技术》,主编:胡之璧,人民卫生出版社.3.《中药生物技术》,主编:贾景明,化学工业出版社.参考文献：1.徐红,王峥涛,胡之璧.中药DNA分子鉴定技术的发展与应用[J].中药现代化,2003,5(2):24-30.2.

海学忠.DNA分子标记在中药鉴定中的应用进展[J].中外健康文摘,2012,9(35):442-446.3.陈士林,郭宝林,张贵君等.中药鉴定学新技术新方法研究进展[J].中国中药杂志,2012,37(8):1043-1055.第二节常用的分子标记1.限制性片段长度多态性（RFLP）RFLP原理：基因组DNA经限制酶切，可产生大量长短不一的片段。通过电泳可以将这些片段分离开。片段长的迁移速度慢，短的迁移速度快。如果一对等位基因（序列）的限制酶切片段长度不同，则称为RFLP。以标有放射性同位素或化学标记物质、来自特定基因座的DNA片段为探针，可以检验该座位是否存在多态性。RFLP原理示意图左边：等位序列酶切电泳的结果右边：用探针检验的结果。1.1产生RFLP的原因点突变：单个碱基的改变（转换或颠换），造成失去某个酶切位点或产生一个新的酶切位点，使突变型酶切片段变长或变短。插入突变：使突变型酶切片段变长。缺失突变：使突变型酶切片段变短。1.2RFLP的检测方法酶切

电泳

Southern杂交

放射自显影结核分枝杆菌基因组RFLP图谱RFLP的优点标记广泛存在于生物体内，不受组织、环境和发育阶段的影响。RFLP标记的等位基因是共显性的，不受杂交的影响，可区分纯合基因与杂合基因。可产生的标记数目很多，可覆盖整个基因组。RFLP的缺点标记技术需要酶切，对DNA质量要求高；RFLP的多态性程度偏低；分子杂交时会用到放射性同位素，对人体和环境都有害；探针的制备、保存和发放也很不方便；分析程序复杂、技术难度大、费时、成本高。1.3RFLP的应用1.遗传学图的构建结合RFLP连锁图，任何能用RFLP探针检测出的基因及其DNA片段都可以通过回交，快速有效地进行转移。2.基因定位利用RFLP技术能够准确地标记定位种质中的目标基因，结合杂交，回交及组织培养等技术就可以快速有效的将所需目标基因的DNA片段引入栽培品种中，实现品种改良。3.遗传多态性分析运用RFLP技术可以尽可能多地保存那些在已知位点上有异态的品系，以求最大程度地保持品种的多样性。4.细胞质遗传研究RFLP技术是对DNA序列自然变异的直接检测，只需选择适当的限制性内切酶或DNA探针作分子标记，因而对植物不同种属或杂种后的细胞质遗传变异及基因型的鉴定具有较高的灵活性和灵敏性，从而能较好地应用于细胞质遗传的研究。2.随机扩增多态性DNA（RAPD）RAPD原理：建立于PCR基础之上，使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物，以较低的退火温度（36℃），对基因组的DNA全部进行PCR扩增，以检测多态性。由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须对每一随机引物单独进行PCR。单一引物与反向重复序列结合，使重复序列之间的区域得以扩增。

引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB(溴化乙锭)染色以检测DNA片段的多态性。RAPD原理示意图OPA1:5’-CAGGCCCTTC-3’OPD11:5’-AGCGCCATTG-3’OPD8:5’-GTGTGCCCCA-3’OPD11OPD8OPA11北柴胡(陕西)

2北柴胡(河北)

3竹叶柴胡4大叶柴胡5小叶黑柴胡6狭叶柴胡MMarkerRAPD的应用-分类鉴定RAPDanalysisof27saffloweraccessionsfromeightdifferentgeographicalregionswithOperonprimerAA-04.AA-04producedsevenpolymorphicbandsLanes1and26:ladder1Kb;Lanes2to27:melon.Arrowsindicatepolymorphicmarkersusedforanalysis.RAPD的优点：技术简单，实验周期短，信息量大，检测速度快；DNA用量少；实验设备简单，不需DNA探针，设计引物也不需要预先克隆标记或进行序列分析；不依赖于种属特异性和基因组的结构，合成一套引物可以用于不同生物基因组分析；用一个引物就可扩增出许多片段，几乎覆盖整个基因组，而且不需要同位素，安全性好。RAPD缺点：显性遗传，不能识别杂合子位点，这使得遗传分析相对复杂，在基因定位、作连锁遗传图时，会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性下降；RAPD对反应条件相当敏感，包括模板浓度、Mg2+浓度，所以实验的稳定性和重复性差。在RAPD和RFLP技术基础上建立了SCAR(Sequencecharacterizedamplifiedregions，序列特异性扩增区域)，CPAS(Cleavedpolymorphicamplifiedsequence，酶切扩增多态序列)和DAF(DNAamplifiedfingerprints，DNA扩增指纹)等标记技术。这些技术的出现，进一步丰富和完善了第一代分子标记，增加了DNA多态性的研究手段。3.SSR标记技术SSR原理：在真核生物基因组中存在许多非编码的重复序列，如重复单位长度在15～65个核苷酸的小卫星DNA，重复单位长度在2～6个核苷酸的微卫星DNA。小卫星和微卫星DNA分布于整个基因组的不同位点。由于重复单位的大小和序列不同以及拷贝数不同,从而构成丰富的长度多态性。

定义：SSR（全称为简单序列长度多态性标记）也称微卫星DNA，是一类由几个(多为1～5个)碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列，其中最常见的是双核苷酸重复，即(CA)n和(TG)n，每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10～60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段。由于核心序列重复数目不同，因而扩增出不同长度的PCR产物，这是检测DNA多态性的一种有效方法。微卫星序列在群体中通常具有很高的多态性，而且一般为共显性，因此是一类很好的分子标记。SSR原理示意图SSR：以2－6个碱基为单位的短重复序列CAAGATCTTGGATTCTTCTTCTTCTTCTTCCGTACATCAGATAG||||||||||||||||||||||||||||||||||||||CAAGATCTTGGATTCTTCTTCTTC......CGTACATCAGATAG上游引物下游引物SSR长度（重复数）容易产生变异相对保守相对保守SSR的检测SSR标记的优点在基因组中数量丰富，分布较均匀存在复等位基因，多态性水平较高一般表现为共显性，信息完整基于PCR技术，简单方便SSR标记的缺点开发成本高，需知道基因组序列，只有全基因组已完成测序的植物才能方便地开发。4.ISSR（SSR间区）在SSR序列上设计引物PCR检测相邻SSR位点之间区段的长度多态性稳定性比RAPD好SSRSSR上游引物下游引物SNP原理：SNP主要是指在基因组水平上由于单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。也即SNP是同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基的变化。

主要表现为基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换或颠换、以及单碱基的插入或缺失等。5.单核苷酸多态性标记(SNP)单核苷酸多态性（SNP）

数量非常丰富，有广阔应用前景。…CAAGATCTTGGAGACTCACTATAGGCTACGCGTACATCAGATAG…||||||||||||||||||||||||||||||||||||…CAAGACCTTGGAGACTAACTATAG.....GCGTACATCGGATAG…SNP检测SNP基因型的生化原理SNP的特点：

SNP与RFLP及SSR标记的不同有2个方面：其一，SNP不再以DNA片段的长度变化作为检测手段，而直接以序列变异作为标记；其二，SNP标记分析完全摒弃了经典的凝胶电泳，代之以最新的DNA芯片技术。对成千上万个克隆测序，用计算机分析数据和显示最终结果。检测：

DNA芯片技术，最新报道的微芯片电泳(Microchipelectrophoresis)，可以高速度地检测临床样品的SNP。杂交型芯片将等位基因特异寡核苷酸共价固定在载体表面，用荧光标记引物扩增基因组DNA，再与芯片上的寡核苷酸杂交形成信号，并行读取芯片上不同SNP荧光信号，获得SNP信息。SNP的优点

数量多，分布广泛，检测快速、易于实现自动化，遗传稳定性高。SNP的缺点成本高，错误信号多。SNP标记的应用

种群生物学特征、遗传性疾病检测、疾病关联分析及特定功能基因或片段的分型等研究，在基因组作图和数量性状定位等方面也有越来越多的应用。第三节药用植物的分子鉴定流程（实例）

DNA测序法（DNASequencing）目前用于DNA测序的基因主要有：1.有叶绿体基因组的rbcL、matK；2.核基因组的rRNA、ITS等(植物类)；3.线粒体基因组的cty-b(动物类)。rbcL：基因分辨率高，变异较均一分布，进化速率差异大，一般用于科级以上分类群研究。matK：位于trnK基因的内含子中，长约1500碱基，编码成熟酶并参与RNA转录体中Ⅱ型内含子的剪切，是叶绿体基因组蛋白编码基因中进化速率最快的基因之一，变异较均一，一般用于种一级分类群亲缘关系研究。rRNA是编码核糖体DNA的基因，在植物中以重复连续排列方式存在，包含进化速率不等的编码区、非编码转录区和转录区，可选择较保守的片断如18S、5S的rRNA进行各种亲缘关系研究。

1.串联重复序列，拷贝可达500~40000；不同ITS拷贝间的序列趋于相近或完全一致。核核糖体内转录间隔区Nuclearribosomeinternaltranscribespacer,ITS

2.序列短，具有长度保守性(ITS1:187-298bp，ITS2:187-252bp)核核糖体内转录间隔区Nuclearribosomeinternaltranscribespacer,ITS

3.核苷酸序列的高度变异性(每个区成对序列趋异百分率在4~10%)

4.两侧都有高度保守的序列材料与方法收集中国境内柴胡标本29种36份，基本涵盖民间入药的所有品种。名称凭证标本采集时间采集地点多枝柴胡B.polyclonum谢晖0405170012004年5月云南会泽川滇柴胡B.candollei谢晖0405170022004年5月云南会泽柴胡（栽培）B.chinense晁志、张道广03080162003年8月陕西镇巴小柴胡B.hamiltonii晁志、张道广03080012003年8月云南昆明狭叶柴胡（红柴胡）B.scorzonerifolium晁志、张道广03070012003年7月安徽肥东空心柴胡B.longicaulevar.franchetii晁志、张道广03080112003年8月陕西镇巴竹叶柴胡B.marginatum晁志、张道广03080022003年8月云南昆明抱茎柴胡B.longicaulevar.mplexicaule晁志、张道广03080032003年8月云南昆明丽江柴胡B.rockii晁志、张道广03080092003年8月云南丽江柴胡(野生)B.chinense晁志、张道广03080202003年8月陕西镇巴汶川柴胡（马尾柴胡）B.wenchuanense晁志、张道广03080512003年8月四川汶川马尔康柴胡B.malconense晁志、张道广03080532003年8月四川汶川柴首B.chaishoui晁志、张道广03080542003年8月四川汶川四川柴胡B.sichuanense晁志、张道广03080522003年8月四川汶川南方大叶柴胡B.longiradiatumf.australe晁志、张道广03070032003年7月安徽黄山韭叶柴胡B.kunmingense潘胜利03871981年8月云南昆明窄竹叶柴胡B.marginatumvar.stenophyllum潘胜利05061993年7月云南昆明线叶柴胡B.angustissimum潘胜利05161993年8月宁夏同心矮小柴胡B.hamiltoniivar.humile潘胜利03201980年8月云南丽江大叶柴胡B.longiradiatumvar.breviradiatum潘胜利04601986年8月黑龙江尚志烟台柴胡B.chinensef.vanheurckii潘胜利04991992年8月山东青岛泸西柴胡B.luxiense潘胜利04141983年8月云南建水长白柴胡B.komarovianum潘胜利04701986年8月吉林长白山大苞柴胡B.euphorbioides潘胜利04681986年8月吉林长白山大叶柴胡B.longiradiatumvar.breviradiatum王峻03090012003年9月黑龙江细茎有柄柴胡B.petiolulatumvar.tenerum晁志、张道广03080102003年8月云南丽江北柴胡B.chinense晁志、张道广03000012003年8月陕西太白山窄竹叶柴胡B.marginatumvar.stenophyllum晁志、张道广03080552003年8月甘肃柴胡B.gansuense潘胜利05131993年8月甘肃榆中县柴胡（栽培）B.chinense谢晖、刘峰林、徐志斌0407210012004年7月甘肃小陇山柴胡B.chinense谢晖、刘峰林、徐志斌0407240012004年7月甘肃天水黑柴胡B.smithii谢晖0407270012004年7月甘肃榆中黄花鸭趾柴胡B.commelynoideumvar.flaviflorum谢晖0407280012004年7月甘肃榆中兴安柴